4. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для коловраток
4. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для коловраток 
4.1. Введение
Коловратки представляют существенную часть планктона морей, включая внутренние морские воды Российской Федерации и являются наиболее распространенным кормом в естественных условиях для личинок многих видов морских рыб и некоторых беспозвоночных. Коловратки эффективно очищают загрязненные воды от бактериальной флоры. Питаются бактериями и одноклеточными водорослями.
Для целей токсикологического эксперимента наиболее пригодна коловратка брасионус пликатилис пликатилис (Brachionus plicatilis plicatilis - Методические рекомендации по биотестированию природных, сточных вод и отдельных загрязняющих веществ. М.: ВНИРО, 1982). Коловратка легко культивируется в лабораторных условиях при солености воды 17 - 25 промилле. Имеет короткий жизненный цикл, дает ряд поколений в течение нескольких дней.
4.2. Характеристика тест-объекта
Коловратка B. plicatilis plicatilis встречается в морях и внутренних морских водах Российской Федерации. Вид эвригалинен и эвритермен. Сравнительно большой размер (около 600 мкм) значительно облегчает проведение токсикологических экспериментов.
По систематическому положению коловратки относятся к низшим червям. Тело коловратки состоит из головы, туловища (покрытого мягким панцирем) и ноги. На переднем конце головы расположен коловращательный аппарат с ресничками, который служит для плавания и захвата пищи. Колебанием ресничек пищевые частицы (микроорганизмы, простейшие, детрит, различные виды одноклеточных водорослей) могут привлекаться или отталкиваться (при избытке или несоответствии пищи).
B. plicatilis plicatilis при культивировании в качестве корма предпочитает более мелкие округлые водорослевые клетки. Обладает способностью регулировать число заглатываемых клеток с помощью фильтрующего аппарата. Размеры пищевых частиц не превышают 12 - 15 мкм.
Размножается коловратка как партеногенетически, так и половым путем. Жизненный цикл B. plicatilis plicatilis состоит из трех периодов: однополого размножения, двуполого размножения и стадии покоя. Эти периоды могут протекать параллельно в одной культуре.
Период однополого размножения начинается вылуплением амиктических (партеногенетических) самок из покоящихся яиц. Амиктические самки не способны к оплодотворению, они производят и вынашивают амиктические яйца, из которых вылупляются либо амиктические самки, либо (в зависимости от условий) миктические самки, способные как к однополому, так и к двуполому размножению. Миктические самки вынашивают миктические яйца, из которых развиваются самцы. В случае оплодотворения, миктическая самка откладывает покоящиеся яйца, из которых после латентного периода снова вылупляются амиктические самки.
Амиктические самки с партеногенетическими яйцами составляют основу здоровой быстро размножающейся популяции коловраток. Плодовитость B. plicatilis plicatilis от 1 до 8 яиц на самку.
После выклева коловратка достигает половозрелости через 20 - 30 ч при температуре 20 - 25 °C, через 16 - 20 ч - при 26 - 28 °C. В это время у нее появляется первое яйцо. Первый вымет молоди коловратки могут дать на 2 - 3 сутки, но массовый вымет наступает на 3 - 4 сутки. Плодовитость самки зависит от ее физиологического состояния и продолжительности жизни, которая колеблется от нескольких дней до 1,5 - 2 недель. За свою жизнь самка откладывает несколько десятков яиц. Длительность сенильного (постпродуктивного) периода самки 2 - 4 суток.
Амиктические и миктические самки, присутствующие в культуре, внешне отличаются по наличию определенного типа яиц.
Амиктические (партеногенетические) яйца, из которых развиваются партеногенетические самки, крупные 115 - 170 мкм, тонкостенные, с полупрозрачным содержимым, в количестве 1 - 3 у одной самки на разных стадиях эмбриогенеза, редко до 7 - 8 штук.
Миктические покоящиеся (оплодотворенные) яйца в количестве не более 3 у одной самки также крупные, размером 115 - 170 мкм, толстостенные, непрозрачные, с темно-коричневым содержимым, прилегающим к оболочке, или с оранжевым содержимым, отстоящим от оболочки на одном из полюсов. Покоящиеся яйца способны переносить различные неблагоприятные условия в водном объекте. Эти яйца морфологически и физиологически разнокачественны, что обуславливает порционность выхода из них коловраток.
Миктические яйца, из которых развиваются самцы, мелкие - размером 80 - 110 мкм, в количестве от 1 до 12 у одной самки, с полупрозрачным содержимым. Продолжительность жизни самцов 3 - 4 суток.
При культивировании следует избегать условий, при которых появляются миктические самки, поскольку их покоящиеся яйца имеют латентный период. Молодь из покоящихся (латентных) яиц может выклевываться через несколько недель, месяцев или даже лет.
Появление покоящихся яиц в культуре обусловлено резким изменением одного или нескольких внешних факторов (повышением или понижением температуры, ухудшением кормового режима, изменением солености и др.).
Переход к двуполому размножению является признаком неблагополучия в культуре, при этом доля миктических самок превышает 10%.
При смешанном размножении в популяции коловраток имеются самцы и самки всех категорий: ювенильные, амиктические, миктические оплодотворенные с покоящимися яйцами и неоплодотворенные, а также сенильные самки. Наличие разных стадий жизненного цикла и их численное соотношение характеризуют состояние культуры коловраток.
4.3. Условия лабораторного содержания
При культивировании коловраток необходимо поддерживать на одном уровне температуру, освещенность, соленость, концентрацию корма и режим кормления во избежание перехода от партеногенетического размножения коловраток к половому.
Культивирование проводят при температуре от 20 °C до 25 °C, как при естественном, так и при искусственном освещении (не менее 500 - 3000 лк) в люминостате, с естественной сменой дня и ночи.
Культивируют коловраток в колбочках объемом 50 - 100 см3. Число колбочек с маточной культурой коловраток должно быть в количестве 2 - 3 штуки. Средой для культивирования является природная или искусственная морская вода (п. 2 Приложения 1).
Кормом являются морские микроводоросли монохризис или изохризис (Monochrysis (Pavlova) lutheri; Isochrysis galbana).
Корм вносят через 2 - 3 суток из расчета 0,5 см3 водорослей (при
4
плотности клеток культуры водорослей 15 x 10 /см3) на 10 мл культуры
коловраток при плотности коловраток 5 - 10 экз./см3.
От концентрации корма зависят многие продукционные показатели культуры коловраток. Если концентрация корма выступает лимитирующим фактором, то сокращается общая продолжительность жизни организмов, их плодовитость, скорость рождаемости.
Избыточное количество корма настолько быстро проходит через пищеварительный аппарат коловраток, что не усваивается и наступает парадоксальная ситуация - избыток корма приводит к голоданию коловраток и снижению продукционных показателей, а кроме того, загрязняет выростные емкости.
Показателем высокого качества маточной культуры является почти полное отсутствие самок с миктическими яйцами, самок с покоящимися яйцами и самцов. В культуре должны преобладать амиктические самки с 1 - 3 и более яйцами.
Маточную культуру коловраток можно создавать из яиц коловраток (по аналогии с артемиями).
В том случае, когда маточную культуру начинают создавать от нескольких десятков амиктических самок, культивирование начинают в микроаквариумах.
В каждую лунку сажают по одной амиктической самке. Молодь из лунок, появляющуюся в течение трех-четырех дней, переносят в колбочки объемом 50 - 150 см3 с морской водой, постепенно увеличивая маточное стадо коловраток до 5 - 10 экз./мл.
При достижении плотности организмов в культуре 100 - 200 экз./см3, среду обновляют: сливают половину культуры из колбочки и добавляют свежую среду (искусственную или природную морскую воду).
Для маточной культуры коловраток желательно иметь хотя бы 1 бюкс объемом не более 50 см3, поскольку в бюксе с широким горлом очень удобно вести контроль за популяционной структурой коловраток. Бюкс можно поставить под бинокуляр и просмотреть всю культуру сразу.
Для культивирования коловраток и проведения токсикологических экспериментов необходимы лабораторное оборудование и реактивы:
весы аналитические;
бинокуляр МБС-9 или МБС-10;
pH-метр;
прибор для измерения солености воды;
микрокомпрессоры;
реактивы для приготовления искусственной морской среды (п. 2 Приложения 1 настоящих Методических указаний);
бумага фильтровальная;
вода дистиллированная;
мерные колбы на 1000, 100, 50 см3;
бюксы с широким горлом на 50 см3;
градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 мл;
пипетки для пересадки коловраток (пастеровские пипетки с укороченным концом);
микроаквариумы;
культура коловраток Brachionus plicatilis plicatilis;
морские микроводоросли для корма Monochrysis (Pavlova) lutheri или Isochrysis galbana.
4.4. Проведение исследований
Токсикологические исследования проводят только на одновозрастной культуре коловраток.
Для получения большого количества одновозрастной культуры отбирают 50 активных самок с яйцами и помещают по одной в микроаквариумы объемом 0,5 см3 каждый (планшет с ячейками). Появившуюся молодь переносят в новые микроаквариумы, заполненные морской водой и кормом. Третий помет коловраток, как правило, является наиболее плодовитым, поэтому, при необходимости использования в эксперименте большого количества организмов, удобнее работать с одновозрастной молодью третьего помета.
Возможно так же получение односуточной культуры для проведения эксперимента путем замачивания яиц коловраток в морской воде. При этом происходит синхронизированный выклев молоди коловраток, что очень важно при постановке опыта.
Односуточная молодь становится половозрелой через 1 - 2 суток (появляется первое яйцо) и дает массовый вымет молоди через 3 - 4 суток.
Периодически, не реже 1 раза в месяц при культивировании коловраток, а
также непосредственно перед постановкой эксперимента, необходимо проводить
контроль чувствительности культуры коловраток к эталонному веществу -
двухромовокислому калию K Cr O марки "хч" или стандарт-титру калия
2 2 7
двухромокислого. Для этого готовят маточный раствор двухромовокислого калия
концентрацией 1 г/дм3. Далее методом разбавления - серию концентраций
150,0; 180,0; 210,0; 240,0 и 300,0 мг/дм3, с которыми проводится
исследование. По данному эталонному веществу LC за 24 ч для коловраток
50
находится в диапазоне 180 - 240 мг/л (соленость 20 промилле).
Если полученное значение ЛК не попало в указанный диапазон
50
концентраций, то эксперименты с данной культурой коловраток не проводят.
Исследование токсического действия веществ на тест-организмы проводят в острых и хронических экспериментах.
4.4.1. Острое токсическое действие вещества исследуют в течение 24 ч.
По результатам эксперимента оценивают выживаемость коловраток за 24 ч и
определяют ЛК вещества.
50
Предварительный эксперимент проводят с 4 - 5 концентрациями вещества, различающимися в 10 раз; например: 0,001; 0,01; 0,1; 1; 10 мг/дм3 и т.д. Этот опыт позволяет установить границы остролетальных концентраций вещества.
Основной эксперимент проводят по результатам предварительного. Выбирают диапазон концентраций вещества, которые вызывают гибель меньше 50% и больше 50% коловраток в предварительном эксперименте. Шаг между концентрациями различается в 2 - 5 раз.
В экспериментальные микроаквариумы объемом по 0,5 мл помещают растворы исследуемых концентраций вещества. В каждый микроаквариум рассаживают по одному экземпляру коловраток возрастом 1 сутки, начиная с контроля и далее от наименьшей концентрации по возрастанию. В контроле и в эксперименте (в каждой концентрации) используют по 20 коловраток.
Условия проведения опытов такие же, как и при культивировании данного объекта. В ходе острых опытов коловраток не кормят.
4.4.2. Хроническое токсическое действие вещества исследуют около 2 недель (11 - 14 дней).
Исследование проводят на 3-х поколениях коловраток. По результатам исследования оценивают (по сравнению с контролем):
а) выживаемость коловраток в разных концентрациях вещества в исходном, в 1-м, 2-м и 3-м поколениях;
б) наступление половозрелости в каждом из трех поколений;
в) плодовитость коловраток в каждом поколении и общую плодовитость.
Половозрелость коловраток отмечают с момента появления первого яйца. Плодовитость коловраток - количество молоди, появившейся в каждом поколении. Общая плодовитость коловраток в каждом поколении определяется как сумма всей молоди за 4 вымета.
Для хронических опытов берут не менее 4 - 5 концентраций вещества, в
установленном диапазоне по ЛК за 24 часа.
50
В контроле и опыте (в каждой концентрации) используют не менее 20 коловраток, помещая в каждую лунку микроаквариума по одному экземпляру возрастом 6 +/- 2 ч.
Коловраток во время проведения эксперимента кормят водорослями раз в 2 - 3 суток. Концентрация клеток водорослей та же, что и при культивировании коловраток. Предварительно культуру водорослей концентрируют центрифугированием. Концентрированный корм добавляют в каждую лунку на кончике пастеровской пипетки.
При проведении опытов на поколениях коловраток (Таблица 4.4.1) придерживаются схемы, аналогично проведению опытов с дафниями.
Таблица 4.4.1
Схема опытов на серии поколений коловраток
┌──────────────┬─────────────────────────────────┬────────────────────────┐ │ Оцениваемое │ Учитываемые пометы │ Сумма молоди │ │ поколение │ │ │ ├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤ │Исходное X │ 0 1 2 3 4│ 1 - 4 │ │ исх.│X , X , X , X , X │SUM X │ │ │ исх. исх. исх. исх. исх.│ исх. │ ├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤ │Первое X │ 0 1 2 3 4 │ 1 - 4 │ │ 1 │X , X , X , X , X │SUM X │ │ │ 1 1 1 1 1 │ 1 │ ├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤ │Второе X │ 0 1 2 3 4 │ 1 - 4 │ │ 2 │X , X , X , X , X │SUM X │ │ │ 2 2 2 2 2 │ 2 │ ├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤ │Третье X │ 0 1 2 3 4 │ 1 - 4 │ │ 3 │X , X , X , X , X │SUM X │ │ │ 3 3 3 3 3 │ 3 │ └──────────────┴─────────────────────────────────┴────────────────────────┘
Примечание. X - поколения; верхний индекс - пометы каждого поколения; нижний - индекс оцениваемое поколение.
Подготовленную для эксперимента культуру коловраток (исходную молодь)
рассаживают в микроаквариумы по 1 экземпляру. После того, как исходные
1 0
особи дали первый помет (1-е поколение - X ), эту молодь отсаживают (X
исх. 1
- "исходная" молодь первого поколения) в том же количестве в другие
лунки-микроаквариумы, соответствующие тем же концентрациям вещества и т.д.
За исходными особями ведут наблюдение до получения 4-х пометов в 3-м опытном и контрольном поколениях. Наблюдения, которые ведутся за исходными особями, повторяют с 1-м, 2-м и 3-м поколениями.
4.5. Учет и анализ результатов
Для определения наличия действия концентрации исследуемого раствора вещества на коловратках отмечают изменение выживаемости, плодовитости, время наступления половозрелости тест-организмов в тестируемом растворе по сравнению с контролем.
Статистически достоверное отклонение от контроля исследуемых показателей в различных концентрациях вещества свидетельствует о наличии действия определенной концентрации вещества на коловраток.
