3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для простейших
3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для простейших 
3.1. Введение
Простейшие, в частности инфузории, составляют до 70% численности гетеротрофного микропланктона в водных объектах. Многочисленность данной группы организмов, экологическая значимость ее в процессах самоочищения, в продукционных процессах, трофических связях, значение ее как составной части естественной кормовой базы зоопланктона и молоди рыб вызывают необходимость исследовать данную группу в токсикологическом плане. Наблюдения показали, что простейшие в силу своих физиологических особенностей проявляют большую чувствительность к изменению факторов внешней среды. Их короткий цикл развития дает возможность проследить действие отдельных токсикантов на ряде поколений. Данные организмы (особенно ресничные инфузории) достаточно легко культивировать. Все это делает простейших удобным тест-объектом для токсикологических опытов.
3.2. Характеристика тест-объекта
В качестве тест-объектов в токсикологических исследованиях используются брюхоресничные инфузории: стилонихия, эуплотус, керонопсис (Stylonichia mytilus; Euplotes harpac, E. trisulkatus, E. sp.; Urostula marina; Keronopsis multistilata).
Стилонихия (Stylonichia mytilus) - солоноватоводная инфузория (размер до 300 мкм), в лабораторных условиях адаптируется к солености до 25 промилле. Обитает в водных объектах с большим содержанием органических веществ, отмирающих растений, ила и т.п. Всеядна, в число ее пищевых объектов входят бактерии, жгутиконосцы, одноклеточные водоросли, детрит. Стилонихия, подобно другим инфузориям, размножается половым и бесполым путем. В процессе бесполого размножения (амитоз) при делении вегетативного ядра (макронуклеуса) происходит постепенное нарушение его генетической структуры, что, в свою очередь, выражается в депрессии и старении клона. При половом процессе в результате слияния микронуклеусов двух конъюгирующих особей развивается новый макронуклеус, что восстанавливает нормальную генетическую структуру последнего и, соответственно, нормализует физиологические функции организма.
Эуплотус (Euplotes harpac), размер до 450 мкм - самая крупная инфузория из рода Euplotes. Инфузории этого рода имеют бесцветное и прозрачное щитовидное тело с очень сильно развитым перистомом, 10 лобно-брюшных циррий, 5 поперечных, 4 умеренно развитых хвостовых циррий играют роль рулей. Инфузории весьма распространены в иле, среди растительности. Помимо E. harpac используются Е. trisulkatus.
Уростула (Urostula marina), размер до 200 мкм, имеет гибкое, малосократимое, яйцевидное тело, ширина которого составляет 1/3 длины. Рот с двумя ундулирующими мембранами, вентральные ряды из низких циррий, краевые ряды выражены слабо, поперечный ряд выражен очень ясно. Обитает среди растений, в незагрязненных водных объектах; прожорливая всеядная форма.
Керонопсис (Keronopsis multistilata), размер до 450 мкм - бентическая инфузория, населяет толщу прибрежного морского песка. Форма длинной ленты, ширина составляет 1/7 длины тела. Ресничный аппарат, позволяющий протискиваться между песчинками, хорошо развит.
Как видно, используемые в качестве тест-организмов инфузории, занимают определенную нишу в водном объекте. Они являются или планктонобентосными формами, или полностью бентическими формами, что позволяет исследовать как растворимую фракцию веществ, так и малорастворимую.
3.3. Условия лабораторного содержания
Монокультуру простейших культивируют при комнатной температуре 20+/-2 °C на искусственной морской среде в чашках Петри при естественном освещении, предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей, или в люминостате.
Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:
реактивы для приготовления искусственной морской среды;
вода дистиллированная;
бумага фильтровальная;
колбы на 1000 см3;
градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 см3;
пипетки для пересадки простейших (Пастеровские пипетки с укороченным концом);
мерные колбы на 100 см3;
мерные пробирки на 10 см3;
чашки Петри;
микроаквариумы (блок камер из оргстекла);
бинокуляр МБС-9 или МБС-10;
оксиметр;
рефрактометр для измерения солености воды;
pH-метр;
двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия
2 2 7
двухромокислого;
культура простейших;
сухие пекарские дрожжи.
Среда для культивирования - традиционно используемая для простейших.
Для приготовления искусственной морской среды делают запас морской воды
соленостью 70 промилле следующего состава (в граммах на 1 дм3): NaCl -
55,30; MgSO x 2H O - 13,84; MgCl x 6H O - 11,02; CaCl x 6H O - 2,9;
4 2 2 2 2 2
KCl - 1,3; NaHCO - 0,5; NaNO - 0,2; NaBr - 0,2; NaHPO - 0,1; KJ - 0,01;
3 3 4
SrCl - 0,03.
2
Все компоненты растворяют отдельно, через одни сутки сливают вместе и общий объем доводят дистиллированной водой до 1 дм3. При хранении морской воды в растворе может выпасть очень незначительный осадок солей, отфильтровывать который не рекомендуется.
Для разведения искусственной морской воды соленостью 70 промилле до нужной солености пользуются формулой Хлебович (1974) : X = (1000 x c) / a,
где X - количество морской воды, необходимое для получения искомой солености в 1000 мл дистиллированной воды;
a - соленость исходной воды (70 промилле);
c - соленость искомой воды.
Можно использовать для приготовления искусственной морской воды готовую профессиональную морскую соль.
В качестве корма используют хорошо высушенные и измельченные пекарские дрожжи, которые легко хранить в закрытой посуде. Вносят их в чашки Петри в очень небольшом количестве на кончике скальпеля.
Два раза в неделю рекомендуется просматривать состояние культуры в чашках Петри. Через две недели культуру пересевают, т.е. 100 - 300 особей пипеткой переносят в чашку Петри с чистой средой, куда добавляют корм.
Периодически (не реже 1 раза в месяц) проводят оценку физиологической
чувствительности организмов. Для этого используют эталонный токсикант
- двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия
2 2 7
двухромокислого. Готовят маточный раствор двухромокислого калия
концентрацией 1 г/дм3. Далее методом разбавления готовят серию растворов с
концентрациями 100,0; 150,0; 200,0; 250,0 и 300,0 мг/дм3. Исследование
проводят в течение 24 ч. По результатам эксперимента рассчитывают летальную
концентрацию K Cr O , вызывающую гибель простейших на 50% (ЛК за 24 ч).
2 2 7 50
Если полученные значения ЛК находятся в интервале 180 - 230,0 мг/дм3, то
50
культура может быть использована для проведения экспериментов.
Если полученные значения ЛК не попадают в интервал 180 - 230,0
50
мг/дм3, эксперименты с простейшими не проводят, выясняют причину,
эксперимент повторяют.
Для получения из природных проб морской воды монокультуры простейших, растущих в лабораторных условиях на искусственной морской среде той же солености, используют соответствующие методические разработки (Методические указания по морским токсикологическим биотестам. М.: ВНИРО, 1978; Методические рекомендации по биотестированию природных, сточных вод и отдельных загрязняющих веществ. М.: ВНИРО, 1982).
3.4. Проведение исследований
Перед постановкой опытов культуру простейших необходимо вывести в экспоненциальную фазу развития, что достигается пересевом культуры за трое суток до постановки опытов в чашку Петри с добавлением корма.
Эксперименты можно проводить как в чашках Петри объемом 25 см3, так и в камерах с рабочим объемом 4 см3. Плотность посадки в чашках Петри (с рабочим объемом 10 мл) 10 организмов, в камерах с рабочим объемом 4 мл - 5 организмов. Повторность двукратная или трехкратная.
Для предварительных и окончательных экспериментов удобно использовать камеры из оргстекла с рабочим объемом 4 см3. Блок камер состоит из двух склеенных между собой пластин размером 20 - 21 x 7 - 8 см. В верхней пластине толщиной около 1 см просверливают отверстия диаметром 3 см. Нижняя пластина толщиной около 0,5 см служит дном. В блоке 12 камер (лунок), которые расположены в два ряда по шесть в каждом. В каждую лунку вносят по 5 инфузорий. Пять рядов используют для различных концентраций вещества, а шестой - для контроля. Повторность при этом двукратная (два ряда лунок в блоке). Сверху микроаквариум закрывают стеклянной пластинкой соответствующего размера, что препятствует испарению раствора.
В качестве показателей токсического действия целесообразно использовать выживаемость и темп деления простейших.
В первом случае в камерах из оргстекла (объем 4 см3) определяют
концентрации вещества, вызывающие гибель (LC , LC , LC ) или любое
16 50 100
повреждающее действие (EC , EC , EC ) подопытных организмов за
16 50 100
определенный срок. Длительность опыта определяется токсичностью среды и
составляет обычно от нескольких часов до 5 суток. Контролем служит
культуральная среда. Наблюдения проводят под бинокуляром каждые сутки.
Эксперименты на простейших проводят в два этапа (предварительный и
окончательный). В предварительном эксперименте находят интервал токсических
концентраций. Опыты ставят в широком диапазоне концентраций токсиканта,
причем предыдущую концентрацию последовательно увеличивают в 10 раз (0,1;
1,0; 10,0 и т.д.). В окончательном эксперименте, установив диапазон
действия токсиканта, разбивают найденный интервал на пять равных
концентраций и устанавливают ЛК .
50
Темп деления простейших определяют в микроаквариумах (планшет с ячейками (лунки диаметром 1 см, глубина 0,5 см). Планшет с микроаквариумами представляет собой стеклянный или изготовленный из оргстекла квадратный или прямоугольный брусок толщиной 1 см с пятью рядами полированных лунок. В каждом ряду, соответственно, 5 или 10 лунок. Микроаквариумы накрывают стеклянной пластинкой во избежание испарения среды из лунок.
Лунки в каждом ряду (5 - 10 лунок) заполняются раствором вещества определенной концентрации. В каждую лунку микроаквариума помещают по одному организму. Ежесуточно в течение нескольких суток (3 - 5 суток) подсчитывают количество организмов в каждой лунке каждого ряда, оставляя, после подсчета организмов, в лунке исходное количество организмов (1 экземпляр), удаляя лишние организмы. Или можно по одному организму переносить в соответствующую лунку с теми же концентрациями вещества аналогичного планшета с микроаквариумами.
3.5. Учет и анализ результатов
В качестве показателя действия токсикантов на тест-объект используют
показатель выживаемости инфузорий за определенный срок наблюдения или
нарушение темпа деления клеток инфузорий, которое выражается в изменении
прироста численности клеток в процентах от контроля. Прирост численности
организмов оценивают по формуле: N = N - N , где N - численность
t 0 t
организмов в конце опыта (или последующие сутки подсчета), а N -
0
численность организмов в начале опыта (или предыдущие сутки подсчета).
Результаты обрабатывают методами статистики.
