7.1.2. Проба на фосфатазу
7.1.2. Проба на фосфатазу 
Качественная реакция. Метод основан на способности фермента фосфатазы расщеплять бариевую соль паранитрофенилфосфата при температуре 38 °C, освобождая паранитрофенол, который окрашивает среду в желтый цвет.
Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; плитка электрическая; баня водяная; ступка фарфоровая диаметром 7 - 9 см; цилиндр вместимостью 1 куб. см; воронка делительная вместимостью 250 куб. см; пробки корковые; капельница; воронки стеклянные диаметром 4 - 5 см; марля; бумага фильтровальная; вата стеклянная; бариевая соль паранитрофосфата, насыщенный раствор; гидроксид натрия, раствор массовой концентрации 400 г/куб. дм (Д = 1,43 г/куб. см); хлорид магния, раствор массовой концентрации 5 г/куб. дм; ацетатный буфер pH 5,4; вода дистиллированная.
Проведение испытания. Измельченную навеску, взятую из внутренней части изделия в количестве 20 г и взвешенную с точностью до 0,01 г, переносят в ступку и растирают, добавляя постепенно 50 куб. см дистиллированной воды. Полученную взвесь процеживают через двойной слой марли, а оставшуюся в марле навеску отжимают, затем вытяжку фильтруют через сухой складчатый фильтр и делят пополам. Одну часть (фильтрат 1) исследуют непосредственно, другую (фильтрат 2) переносят в коническую колбу, доводят до кипения и снова фильтруют - эта часть фильтрата является контрольной.
Для проверки активности фосфатазы в пробирку отмеривают 1 куб. см фильтрата 1, прибавляют 2 капли раствора хлорида магния массовой концентрации 5 г/куб. дм, 2 капли ацетатного буфера (pH 5,4) и 0,5 куб. см раствора бариевой соли паранитрофенилфосфата.
Для контроля во вторую пробирку отмеривают 1 куб. см фильтрата 2 и добавляют те же реактивы, что и в первую. Обе пробирки помещают на 1 ч в водяную баню или термостат при температуре 37 - 38 °C. Затем в обе пробирки добавляют по капле раствора гидроксида натра.
При достаточной тепловой обработке кулинарного изделия окраска в обеих пробирках не меняется. При недостаточной тепловой обработке раствор желтеет.
Определение остаточной активности кислой фосфатазы (количественное определение). Метод основан на фотометрическом определении в продукте интенсивности развивающейся окраски, зависящей от остаточной активности кислой фосфатазы, выраженной массовой долей фенола.
Аппаратура, материалы, реактивы. Весы лабораторные; потенциометр с погрешностью измерения +/- 0,06 pH; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра; ультратермостат или водяная баня; воронки; колбы мерные вместимостью 500 и 1000 куб. см; пипетки градуированные на 1; 5; 10 куб. см; палочки стеклянные; пробирки; бумага фильтровальная; груша резиновая; кислота лимонная; цитрат натрия 5-водный; динатриевая соль фенилфосфорной кислоты, раствор массовой концентрации 2 г/куб. дм, свежеприготовленный; кислота трихлоруксусная, кристаллическая, растворы массовой концентрации 50 и 200 г/куб. дм; гидроксид натрия, раствор C(NaOH) = 0,5 моль/куб. дм; вода дистиллированная; фенол; толуол; вольфрамат натрия; сульфат лития 1-водный; кислота ортофосфорная плотностью 1,72 г/куб. см; кислота соляная плотностью 1,19 г/куб. см; бром.
Подготовка к испытанию. Ацетатный буфер: в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см в дистиллированной воде растворяют 13,88 г цитрата натрия и 0,588 г лимонной кислоты, доливают водой до метки и перемешивают, pH буфера 6,5. Затем добавляют 1 куб. см толуола. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 +/- 1 °C не более 12 сут.
Реактив Фолина: 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 куб. см дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 куб. см ортофосфорной кислоты и 100 куб. см соляной кислоты. Смесь осторожно кипятят в течение 10 ч в колбе вместимостью 2000 куб. см с обратным холодильником, после чего охлаждают и добавляют 150 г сульфата лития, 50 куб. см воды и несколько капель брома. Остаток брома отгоняют кипячением смеси без холодильника в вытяжном шкафу, охлаждают, переносят в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, доводят объем дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют. Реактив должен быть золотисто-желтого цвета без зеленого оттенка; его хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте не более 6 мес.
Стандартный раствор: 2 г фенола (взвешивают с точностью до 0,001 г) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см, доводят объем до метки и перемешивают. Отбирают пипеткой с помощью резиновой груши 5 куб. см раствора в колбу вместимостью 500 куб. см, добавляют около 300 куб. см дистиллированной воды, вносят 25 г кристаллической трихлоруксусной кислоты. После растворения содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают. Полученный раствор содержит 20 мкг фенола в 1 куб. см.
Построение градуировочного графика. В пробирки вносят следующие объемы стандартного раствора: 0; 0,25; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 куб. см, что соответствует массе фенола: 0; 5; 10; 20; 30; 40 мкг. Доводят объем каждой пробирки до 2,5 куб. см, добавляя соответствующий объем раствора трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/куб. дм (2,5; 2,25; 2,0; 1,5; 1,0; 0,5 куб. см), и перемешивают. В каждую пробирку добавляют 5 куб. см раствора гидроксида натрия, перемешивают, выдерживают 10 мин., добавляют 1,5 куб. см реактива Фолина, разведенного дистиллированной водой в соотношении 1:2, и перемешивают.
Через 30 мин. измеряют оптическую плотность растворов по отношению к раствору трихлоруксусной кислоты массовой концентрации 50 г/куб. дм на фотоэлектроколориметре с применением светофильтра с длиной волны 600 +/- 10 нм в кювете с расстоянием между рабочими гранями 10 мм или спектрофотометра при длине волны 600 нм в кювете аналогичного размера.
По полученным средним данным по трем стандартным растворам на миллиметровой бумаге размером 20 x 20 см строят градуировочный график. На оси абсцисс откладывают значение массовой доли фенола (микрограмм в 9 куб. см окрашенного раствора); на оси ординат - значение соответствующей оптической плотности (Д). Градуировочный график должен проходить через начало координат (рис. 5 - не приводится).
Рисунки должны быть выполнены сначала на миллиметровке и затем на кальке.
Проведение испытания. От объединенной пробы, подготовленной к испытанию, берут 2 навески массой по 1 г (с точностью до 0,001 г) и переносят в две пробирки (контрольную и опытную).
В пробирки вносят по 10 куб. см ацетатного буфера pH 6,5, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и настаивают в течение 20 мин. при температуре 20 °C, периодически перемешивая.
В контрольную пробирку добавляют 5 куб. см 200 г/куб. дм раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и добавляют 5 куб. см 2 г/куб. дм раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты, выдерживают 10 мин. и фильтруют.
В опытную пробирку добавляют 5 куб. см 2 г/куб. дм раствора динатриевой соли фенилфосфорной кислоты и помещают в ультратермостат при температуре 39 +/- 1 °C на 1 ч, затем добавляют 5 куб. см 200 г/куб. дм раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживают 10 мин. и фильтруют.
Для проведения цветной реакции из контрольной и опытной пробирок отбирают по 2,5 куб. см безбелкового фильтрата. Цветную реакцию проводят по методу, описанному выше.
Массу фенола в навеске определяют по градуировочному графику.
Обработка результатов. Массовую долю фенола (X, %) вычисляют по формуле:
(m - m ) x 20 x 100
1 2
X = --------------------, (100)
6
m x 2,5 x 10
где:
m - масса фенола в опытной пробирке, найденная по
1
градуировочному графику, мкг;
m - масса фенола в контрольной пробирке, найденная по
2
градуировочному графику, мкг;
m - масса анализируемой пробы, г;
6
10 - коэффициент пересчета;
20 - разведение;
2,5 - объем фильтрата, отобранный для цветной реакции, куб.
см.
Вычисление проводят до 0,0001.
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, допустимое расхождение между которыми при P = 0,95 не должно превышать 10% по отношению к среднему арифметическому.
Окончательный результат определяют до 0,001.
