5.2. Хирономиды
5.2. Хирономиды 
5.2.1. Характеристика тест-объекта
Из пресноводных бентосных организмов инфауны (зарывающихся в грунт) для проведения токсикологических опытов используются хирономиды. Хирономус дорзалис (Chironomus dorsalis Meig.) относится к широко распространенному семейству хирономид, личинки темно-красного цвета обитают в иле стоячих водных объектов, где строят в грунте трубчатые домики. Окукливание наступает чаще всего на 12 - 13-е сутки. Перед окукливанием личинки перестают питаться, теряют активность. Стадия куколки длится 2 - 3 суток. В конце этой стадии куколки из олигофотных становятся полифотными, покидают грунт и всплывают к поверхности воды, где происходит вылупление комаров из кукольной шкурки через ее разрыв на дорсальной стороне груди. Общая продолжительность жизни комаров 3 - 5 суток. В течение этого времени ни самцы, ни самки не питаются. После выклева из яиц личинки покидают кладку и плавают в воде, через несколько дней они оседают на грунт, переходя к донному образу жизни. Их дальнейшие рост и развитие определяются в основном условиями питания, дыхания, качеством грунта, температурным режимом, плотностью популяции и некоторыми другими факторами.
5.2.2. Условия лабораторного содержания
Хирономиды легко поддаются культивированию в искусственных условиях, и их личинки служат важным кормовым объектом.
При содержании мотыля в искусственных условиях создание и поддержание маточного роя комаров нужной численности осуществляется по той же методике, что и выращивание личинок. Разница состоит лишь в том, что их не отбирают на опыт, а дают им возможность закончить метаморфоз.
Устройство для выведения хирономид (хирономидник) представляет собой деревянный каркас, обтянутый марлей. Комната, где расположен хирономидник, должна быть достаточно светлой, высота хирономидника должна быть не менее 2,5 - 3 м. Поскольку взрослые комары не питаются, содержание маточного роя заключается в контроле за водным режимом в кюветах, в кормлении растущих личинок и в соблюдении чистоты воздуха (недопустимо наличие дыма, запаха нефтепродуктов, красок и т.п.).
Яйца, откладываемые комарами, собирают, и 20 - 30% их идет на воспроизводство маточного роя, остальная часть используется в качестве посадочного материала для токсикологических опытов. Яйцекладки можно вносить сразу на поверхность ила, однако лучшие результаты получают, используя их предварительное выдерживание в чистой воде до массового выклева личинок. Для постановки опытов выклюнувшуюся молодь выращивают в выростных кюветах до размеров 3 - 4 мм. В качестве корма используют сухие белковые дрожжи.
Для культивирования удобнее использовать фотографические кюветы высотой 2,5 - 3 см со сторонами размером 13 x 16 см. Кюветы размещают в несколько ярусов на деревянном или металлическом стеллаже в хирономиднике. Просвет между стенками кювет, расположенных на стеллаже по вертикали одна над другой, составляет 10 - 15 см, число ярусов - 7 - 15 см в зависимости от высоты хирономидника.
Наиболее целесообразно выращивание личинок на "тонком" речном иле, накапливающемся на участках с затишным течением. Желательно, чтобы слой ила был толщиной 12 - 15 мм. Хороший результат дает уменьшение водного слоя вплоть до его полного исчезновения. Лучше выращивать личинок во влажном грунте, периодически обрызгиваемом водой во избежание подсыхания. При поддержании комнатной температуры культивирование мотыля может идти круглогодично.
Личинок выращивают в кюветах, заполненных наполовину сметанообразной массой смеси ила с водой. Качество прудового или речного ила может быть улучшено его прогреванием до температуры 50 - 60 °C, обуславливающим уничтожение организмов, которые могут оказаться хищными по отношению к разводимым личинкам (личинки жуков, стрекоз, другие виды хирономид).
После отстаивания грунтовой массы, налитой в кюветы (4 - 5 ч), вносят кладки, предварительно выдержанные в чистой воде до выхода первых личинок из слизи. На 1 м поверхности вносится примерно 100 - 150 кладок. Яйцекладки нужно распределять равномерно во избежание их заглубления в грунт. При температуре 18 - 20 °C сухие белковые дрожжи в виде порошка двукратно распыляют по поверхности грунта из расчета 30 - 40 г/м. При температуре выше 18 - 20 °C единовременное внесение большого количества корма может привести к интенсивному развитию гнилостных процессов с выделением метана и сероводорода. В связи с этим лучше вносить корм каждые 3 - 4 суток, причем вносимую порцию необходимо увеличивать соответственно росту личинок. Последнюю порцию корма вносят за 2 - 3 суток до отбора личинок.
Для получения яиц в маточном помещении устанавливают стеклянные кюветы или кристаллизаторы высотой 5 - 10 см и площадью 400 - 1600 см2 и наливают в них чистую воду толщиной слоя 2 - 3 см. Ежедневно (лучше в середине дня, чтобы не мешать роению) выбирают яйцекладки пинцетом выше уреза воды, где они прикрепляются. Затем кристаллизаторы ополаскивают для удаления обрывков кладок и заполняют чистой водой. Один-два раза в месяц кюветы и кристаллизаторы рекомендуется протирать спиртом.
5.2.3. Проведение исследований
Эксперименты на хирономидах можно проводить в трех вариантах:
а) в чашках Петри или Коха с регулярной заменой среды;
б) в циркуляционных устройствах;
в) в проточных установках.
В опытах с осуществлением проточности установка представляет собой два расположенных один над другим сосуда, между которыми находятся чашка Петри с подопытными организмами (10 экземпляров в чашке).
Соответствующие концентрации токсичного вещества, введенные в верхний сосуд, по каплям проходят через чашки, стекая в нижний сосуд. Таким образом обеспечиваются проточность и аэрация.
Выбор концентраций определяется токсичностью того или иного вещества. Опытные растворы готовят на дехлорированной воде и меняют раз в двое суток. Нестойкие токсичные вещества необходимо менять каждый день. Объем 2 дм3 в проточной установке обеспечивает подачу опытной жидкости в течение 10 - 12 ч, после чего ее снова переливают в верхние сосуды. Температуру измеряют три раза в день.
Растертые в порошок и просеянные через сито N 27 белковые дрожжи замачивают в воде до получения густой массы, затем вносят в опытную чашку стеклянной палочкой. Масса, опущенная на конце стеклянной палочки, располагается под водой в опытной чашке в форме кружков диаметром 6 - 8 мм. Десяти маленьким личинкам в начале опыта хватает 3 - 4 кружков. По мере роста личинок количество корма, вносимого в опытные чашки, увеличивают.
С начала окукливания кормление сводится к минимуму, а к моменту вылета имаго совсем прекращается. Дрожжи используются хирономидами и как строительный материал для домиков. Разведенные дрожжи на протяжении всего опыта хранят в холодном месте.
Острые опыты проводят без добавления грунта в течение 10 - 15 суток. Длительность хронических опытов от III стадии личинки (длиной 3 - 4 мм) до вылета имаго составляет около 30 суток.
Вначале отбирают одну из кладок хирономид (в ней до 200 яиц) в кристаллизатор с водой. После вылупления личинок их подращивают на иле до определенного размера (3 - 4 мм) и затем сифоном со стеклянной трубочкой осторожно отбирают по 10 экземпляров на опытную чашку. В течение двух суток они обживают опытные площади (чашки), строят домики из дрожжей, вносимых заранее. Слабых особей заменяют новыми из той же одновозрастной популяции. К концу вторых суток личинки подрастают до 3-й стадии (4 - 5 мм). Перед опытом воду из опытной чашки отсасывают сифоном вместе с остатками корма и заменяют раствором определенной концентрации. Опытную жидкость следует менять по возможности быстро, чтобы куколки и личинки не обсыхали. После очистки опытную чашку наполняют на 2/3 жидкостью и только затем вносят корм. Каждая концентрация испытывается в трех повторностях.
5.2.4. Учет и анализ результатов
При проведении токсикологических опытов регистрируются следующие показатели:
основные:
а) выживаемость личинок;
б) сроки их окукливания;
в) сроки и процент вылетевших комаров;
г) процент уродливых особей;
дополнительные:
а) окраска личинок;
б) их поведенческие реакции;
в) вес;
г) активность имаго.
Среди погибших имаго встречаются насекомые, которые не смогли высвободиться из экзувия или при выходе из него повредили конечности или крылья. Часто встречаются имаго с уродствами, обусловленными действием токсических веществ, в частности кровоизлиянием в области брюшка, крыльев или общим кровоизлиянием. Такие экземпляры с трудом высвобождаются из экзувия. При выходе они еще больше раздуваются, происходит выпячивание отдельных участков тела между хитиновыми пластинками в области брюшка с последующим их разрывом.
У некоторых особей под действием токсичных веществ кишечник выпадает наружу. Вес личинок регистрируется на 7-е и 10-е сутки опыта.
Наблюдения за организмами ведутся ежедневно. Дрожжевые домики вскоре становятся непроницаемыми, и наблюдения ведутся в основном за пораженными особями, которые обычно остаются в домиках. Особое внимание обращают на форму домиков, поведение организмов, окраску тела, стадию, готовность к линьке и окукливанию, наполнение кишечника. Погибших особей измеряют и рассматривают под бинокуляром.
Размеры живых зрелых куколок и имаго в опыте и контроле можно оценивать визуально. Здоровые особи, как правило, не покидают домиков даже на небольшой срок. Сравнивают линейные размеры погибших особей с их первоначальной длиной и имеющимися в литературе нормативами роста для хирономид.
Для оценки острого летального действия можно использовать два способа:
а) определение концентраций, вызывающих гибель за определенный срок 50% особей, взятых в опыт;
б) определение медианного летального времени для ряда концентраций, а по форме кривой - границы между остролетальными и хронически летальными концентрациями.
В течение длительных опытов учитывают и основные, и дополнительные показатели, указанные выше. Выживаемость всех стадий выражают в процентах с поправкой по Абботу. Личинок взвешивают на торзионных весах на 7-е и 10-е сутки опыта. Удельный прирост биомассы определяют по формуле:
P = [(P - P ) / P ] x 100,
кон нач нач
где: P и P - вес в начале и в конце опыта соответственно.
нач кон
Личинок после взвешивания в опыте не используют из-за травмирования, а эксперименты продолжаются с особями двух других линий той же популяции.
Регистрируют сроки вылета насекомых (в сутках) и проводят статистическую обработку данных.
По окончании опыта все полученные данные сводят в таблицу согласно форме 7.
Форма 7
Оценка токсического действия вещества на хирономид
(среднее 00 из трех повторностей)
┌────────┬─────────┬──────────────────────┬─────────────┬───────┬─────────┐ │Концент-│ Число │ Мертвые особи │ Выживаемость│ Сутки │Критерий │ │ация │личинок в│ (экземпляры) │ с поправкой │вылета │достовер-│ │(мг/л) │варианте ├────────┬───────┬─────┤по Абботу (%)│M +/- m│ности (t)│ │ │ │личинки │куколки│имаго│ │ │ │ ├────────┼─────────┼────────┼───────┼─────┼─────────────┼───────┼─────────┤ │Контроль│ │ │ │ │ │ │ │ │C │ │ │ │ │ │ │ │ │ 1 │ │ │ │ │ │ │ │ │C │ │ │ │ │ │ │ │ │ 2 │ │ │ │ │ │ │ │ │C │ │ │ │ │ │ │ │ │ 3 │ │ │ │ │ │ │ │ │и т.д. │ │ │ │ │ │ │ │ └────────┴─────────┴────────┴───────┴─────┴─────────────┴───────┴─────────┘
Примечание: C - концентрация вещества.
