4.2. Цериодафния
4.2. Цериодафния 
4.2.1. Характеристика тест-объекта
Цериодафнии - рачки вида Ceriodaphnia affinis Lilljeborg (класс Crustacea, отряд Cladocera, семейство Daphnidae) обитают в пресноводных водных объектах Европы, Северной Африки, Азии, Северной Америки. Этот вид относится к олиго- и бетамезосапробам и населяет водные объекты с замедленным течением - неглубокие озера, реки, водохранилища. Сведения о морфологии и физиологии рачков опубликованы ранее (РД 118-02-90 утвержден Госкомприроды СССР от 6 августа 1990 г. N 37 "Методическое руководство по биотестированию воды". М: 1991; Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).
Цериодафния имеет более мелкие размеры, чем дафнии, половозрелые самки 1,5 мм, самцы - 0,8 мм, что позволяет в опытах манипулировать с меньшими объемами воды и более компактными емкостями. Биологический цикл развития от рождения до половозрелости у цериодафний вдвое короче, чем у дафний, при оптимальных условиях развития. Так, при температуре 25 °C созревание наступает на 2 - 3-и сутки от рождения, время первого помета - на 3 - 4-е сутки, а за срок 7 - 8 суток у рачков получают 3 помета.
При температуре 18 °C сроки получения трех пометов у рачков могут растянуться до 28 суток. Численность молоди у рачков в первом помете невелика - по 2 - 6 особей, а начиная со второго помета - от 6 до 20 особей на самку. Этот вид цериодафний моно- или дицикличен. Максимум полового периода размножения приходится на август - сентябрь, самки образуют эфиппиум с одним яйцом. В лабораторных условиях самцы появляются при недостаточном освещении, снижении температуры, концентрации растворенного кислорода, голодании.
Цериодафния более чувствительна к кислородному фактору, чем дафния.
Нормальное развитие цериодафний протекает при концентрации растворенного в
воде кислорода не ниже 5 мгO /л. Вследствие этого цериодафнии более
2
чувствительны к органическому загрязнению и веществам, снижающим
концентрацию растворенного кислорода в среде.
4.2.2. Условия лабораторного содержания
Требования к помещению, где содержат цериодафний, такие же, как и с дафниями. Не допустима обработка помещения химическими веществами с целью уничтожения насекомых и грызунов.
Для культивирования цериодафнии используют дехлорированную, отстоянную воду, которая должна удовлетворять следующим требованиям:
а) pH 7,0 - 8,2;
б) общая жесткость - 1,3 - 2,0 мг·экв/л;
в) содержание растворенного кислорода - 7,0 - 8,0 мгO /л.
2
В качестве корма для цериодафний используют хлореллу - зеленые протококковые водоросли (Chlorella vulgaris) и пекарские дрожжи. Процедура выращивания водорослей приведена в разделе с дафниями (п. 4 Приложения 2).
Для культивирования цериодафний удобны небольшие кристаллизаторы или стаканы емкостью 0,5 - 1 дм3, плотность посадки рачков - из расчета не менее 20 см3 объема среды на одну особь. С целью адаптации рачков к условиям новой лаборатории их помещают в смешанную воду: 1 часть среды, в которой рачки жили ранее, и 3 части лабораторной воды. Кормление проводят ежедневно, водоросли вносят в концентрации 250 - 500 тыс. кл/см3; дрожжи дают не чаще одного раза в неделю, желательно перед сменой раствора в концентрации 1 - 2 см3 1% раствора на 1 дм3. Культуральная среда обновляется полностью один раз в неделю.
Культуру цериодафний выращивают в климатостате, люминостате или боксе при оптимальных условиях содержания: температура 25 +/- 1 °C, освещенность - 400 - 600 лк, продолжительность светового дня - 10 - 12 ч.
При культивировании цериодафний удобно одновременно содержать рачков двух поколений - материнские размножающиеся особи и подрастающую молодь. Продолжительность использования маточных культур ограничивают 15 - 20 сутками. Отмечается каждое родившееся в лаборатории поколение и ставится дата рождения.
Для токсикологических исследований используют цериодафний, начиная с
третьего поколения. Рачков в возрасте 4 +/- 2 ч исследуют на устойчивость к
стандартному токсиканту - бихромату калия в остром опыте, величина ЛК
50
бихромата калия за 24 ч находится в интервале 1,0 - 2,2 мг/дм3.
В дальнейшем эксперименты с бихроматом калия ставят одновременно с постановкой основного острого опыта с каждым веществом.
4.2.3. Проведение исследований
4.2.3.1. Острый опыт. Предварительный острый опыт проводят с набором 3 - 5 концентраций веществ, различающихся в 10 раз: 100,0 - 0,001 мг/дм3. Длительность этого опыта 24 ч, он устанавливает порядок остролетальных концентраций веществ.
Основной острый опыт проводится исходя из результатов предварительного варианта с набором около 5 концентраций вещества. Выбирают диапазон концентраций вещества, которые вызывают иммобилизацию или гибель рачков в интервале 10 - 90%. Обычно эти концентрации отличаются от минимальной летальной в 2 раза. Продолжительность основного острого опыта - 48 ч.
4.2.3.2. Проведение эксперимента. В экспериментальные стеклянные стаканы емкостью 50 см3 или пробирки наливают по 20 см3 испытуемых растворов и сажают по 4 рачка в возрасте 6 +/- 2 часа. При постановке острых опытов используют на каждую концентрацию не менее 20 рачков, распределяя их не менее чем на 4 повторности.
Условия проведения опытов: температура 24 +/- 1 °C, световой день - 10 - 12 ч, разбавляющая контрольная вода должна отвечать всем требованиям, перечисленным выше. В ходе острых опытов рачков не кормят. Смену растворов проводят ежедневно.
В остром опыте показателем токсичности среды является выживаемость
цериодафний. Наблюдения за выживаемостью ведут в том же режиме, что и в
опытах с дафниями, и полученные данные записывают в таблицу (п. 4.1.5
Приложения 2 к настоящим Методическим указаниям). По результатам острых
опытов рассчитывают величины ЛК за 48 ч, определяют действующие
50
концентрации вещества по наличию статистически достоверного снижения
величины выживаемости цериодафний в опыте по сравнению с контролем.
Достоверность получаемых результатов можно считать надежной, если удовлетворены следующие условия:
а) гибель контрольных цериодафний не превышает 10%;
б) ЛК бихромата калия за 24 ч для цериодафний в возрасте 6 +/- 2 ч
50
находится в интервале 1,0 - 2,2 мг/дм;
в) содержание растворенного O в исследуемых растворах, определенное в
2
конце опыта, не ниже 5,0 мгO /дм3.
2
4.2.3.3. Хронический опыт. Хронические опыты на серии трех поколений с цериодафниями, так же как и с дафниями, служат для оценки действия малых концентраций токсиканта на выживаемость, плодовитость и качество потомства в поколениях.
Для хронических опытов подбирают 3 - 4 концентрации вещества,
составляющие 0,5 - 0,001 от ЛК за 24 ч.
50
4.2.3.4. Проведение эксперимента. В опытные стаканы заливают по 40 см3 испытуемых растворов и контрольной воды и помещают в них по 4 экземпляра одновозрастных цериодафний возрастом 6 +/- 2 часа, повторность пятикратная. Рачков ежедневно кормят зелеными водорослями в концентрации 250 - 500 тыс. кл/см3. Смену растворов проводят через сутки до начала размножения рачков и ежедневно в последующем. При смене растворов сохраняют соотношение 10 см3 на 1 исходную цериодафнию, если рачки погибают, количество раствора пропорционально уменьшают.
Продолжительность опытов с каждым поколением цериодафний определяется временем появления четырех пометов у контрольных рачков, что составляет около 10 суток, а общая продолжительность опытов на трех генерациях - от 20 до 25 суток.
Схема постановки опытов на поколениях цериодафний аналогична постановке опытов с дафниями.
В хроническом опыте ведут учет выживаемости и размножения цериодафний. При наблюдении за размножением учитывают время наступления половозрелости и первого помета, количество молоди в пометах и количество патологических отклонений (абортивные яйца и эмбрионы, уродливая и мертворожденная молодь).
Наблюдения в опытах ведут ежедневно, регистрируемые результаты заносят в таблицу по форме 1 и 2 (п. 4.1.4 Приложения 2).
По окончании опытов с каждым поколением цериодафний подсчитывают среднее значение по суткам выживаемости, плодовитости в пересчете на одну самку за 4 помета, процент патологических отклонений от величины реальной плодовитости. Результаты опытов сравнивают с контролем, достоверность отклонений определяется обычными методами вариационной статистики.
Достоверность получаемых результатов в хроническом опыте можно считать надежной, если соблюдены следующие условия:
а) гибель в контроле на конец опыта не превышает 10%;
б) 4 помета в контроле получены за срок около 10 суток;
в) количество молоди на 1 самку за 4 помета в контроле не менее 20 штук;
г) время наступления половозрелости у цериодафний в контроле не превышает 5 суток;
д) ЛК бихромата калия за 24 ч для цериодафний из контрольных
50
растворов находятся в интервале 1,0 - 2,2 мг/л.
