4.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ

4.1.1. Введение

Предлагаемая методика с использованием дафний вошла в состав ряда методических указаний и рекомендаций по установлению токсичности сточных и природных вод (РД 118-02-90 утвержден Госкомприроды СССР от 6 августа 1990 г. N 37 "Методическое руководство по биотестированию воды"; Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).

4.1.2. Характеристика тест-объекта

Рачки вида Daphnia magna Straus (класс Crustacea, отряд Cladocera) обитают в стоячих и слабопроточных водных объектах, особенно часто - во временных лужах, и распространены повсеместно на территории России.

    Этот  вид  является  типичным  бетамезосапробом, перенося осолонение до
6 промилле. Оптимальное  содержание  кислорода  для дафнии составляет 7 - 8
мг/л, однако рачок способен переносить снижение концентрации O  до 2 мг/л.
                                                              2

Оптимальные значения активной реакции среды pH составляют 7,0 - 8,0, однако временные изменения pH в пределах 5,8 - 9,0 не подавляют существенным образом жизнедеятельность дафнии.

При культивировании и проведении токсикологических опытов необходимо поддерживать непрерывное партеногенетическое размножение рачков, учитывая особенности биологического цикла развития рачков.

Длительное культивирование дафний в лабораторных условиях позволяет установить пределы изменчивости основных биологических показателей рачков в зависимости от сезона. В оптимальных условиях содержания выживаемость дафний не зависит от времени года, оставаясь на уровне 80 - 100% к концу опытов. Средние значения плодовитости за 30 суток опытов (за это время получают 7 - 8 пометов) составляют от 60 до 170 экземпляров молоди на одну самку. Могут наблюдаться повторяющиеся снижения плодовитости рачков в зимний (ноябрь - январь) и летний (июнь - июль) периоды. Длительность культивирования рачков в лаборатории в оптимальных условиях даже в течение 10 лет не влияет на результаты опытов.

4.1.3. Условия лабораторного содержания

Работу с дафниями необходимо проводить в помещении, где не используются химические летучие вещества. Недопустима также обработка помещения хлор- и фосфорорганическими пестицидами для борьбы с насекомыми и грызунами.

Дафний отлавливают в природном водном объекте (или получают культуру в одной из специализированных лабораторий). Для постепенной адаптации дафний рекомендуется смешивать 1 часть воды из природного водного объекта или воды, в которой рачки предварительно культивировались, с тремя частями лабораторной воды. Культуральная среда обновляется полностью или частично 1 раз в неделю.

Стабильные условия культивирования обеспечиваются в специально устроенном шкафу - термолюменостате. Он представляет собой застекленный бокс с раздвижными стеклами и рядом полок для сосудов. Хорошо предусмотреть ряд секций для раздельного содержания маточных культур дафний и постановки хронических экспериментов. В шкафу монтируются лампы дневного света, обеспечивающие освещенность около 400 - 600 люкс в течение 10 - 12 ч в сутки. В шкаф может быть встроен обогреватель с контактным термометром, обеспечивающим температуру 20 +/- 2 °C.

Для культивирования дафний используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемых водных объектов. Отбор воды из природных водных объектов лучше производить в ясную погоду, желательно после ряда дней без дождя. Неблагоприятное действие на рачков может оказать вода, взятая в паводковый период. Природную воду необходимо процеживать через сито (N 68 - 72) во избежание попадания простейших и коловраток, которые могут паразитировать на рачках. Водопроводной водой можно пользоваться после предварительного удаления из нее остаточного хлора путем длительного продувания воздуха с помощью микрокомпрессора (около 14 дней). На дно аквариума насыпают хорошо промытый песок, сажают 5 - 10 растений.

Основные гидрохимические показатели воды, используемой для культивирования дафний, должны находиться в следующих пределах:

    а) содержание кислорода 7 - 8 мг O /л;
                                      2

б) pH - 7,0 - 8,2;

    в) окисляемость по Кубелю 4,2 - 5,8 мг O /л;
                                            2
    г) общая жесткость 3,0 - 6,5 мг·экв/л (20 +/- 5 мг CaCO );
                                                           3

д) соотношение Ca/Mg 4:1;

          +     -
    е)  NH  , NO    - отсутствие, следы. В почти всех остальных случаях без
          3     2
знаков препинания!

В качестве основного корма для дафний могут быть использованы зеленые протококковые водоросли и в качестве дополнительного - пекарские дрожжи только для маточных культур. Дрожжами дафний можно подкармливать 1 - 2 раза в неделю из расчета 3 мл 1%-й суспензии на 1 дм3 среды. Взвесь дрожжей хранится в холодильнике не более трех дней.

Состав сред для культивирования кормовых водорослей представлен в таблице 4.1.1.

Быстрый рост накопительной культуры водорослей хлореллы (Chlorella vulgaris) создается при соблюдении следующих условий: питательная среда с добавлением микроэлементов (Тамия), круглосуточное освещение лампами дневного света (2 - 4 тыс. лк) и интенсивное продувание атмосферного воздуха (аэрация) с помощью микрокомпрессоров. При выращивании водорослей на средах Успенского и Прата (с меньшим количеством солей) аэрация не требуется, но рост водорослей идет значительно медленнее.

Питательные среды для водорослей готовят на дистиллированной воде (п. 2.2 Приложения 1 настоящих Методических указаний). Растворы солей железа и микроэлементов можно добавлять во все среды независимо от того, указано это в прописи среды или нет.

Исходная концентрация водорослей должна быть около 2 млн. кл./дм3. Через 7 - 10 дней роста в оптимальных условиях культура достигает максимальной плотности.

Для кормления водоросли отделяют от питательной среды путем центрифугирования или отстаивания в холодильнике в течение 3 - 5 дней. Осадок разбавляется дистиллированной водой и хранится в холодильнике не более трех недель.

Таблица 4.1.1

Состав сред для культивирования кормовых водорослей

┌─────────────────┬───────────────────────────────────────────────────────┐
│      Соли       │           Содержание солей в средах, г/дм3            │
│                 ├──────────────────────────────┬────────────┬───────────┤
│                 │            Тамия             │ Успенского │   Прата   │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│KNO              │5,00                          │0,025       │0,1        │
│   3             │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│MgSO  7H O       │2,50                          │0,025       │0,01       │
│    4   2        │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│K HPO  3H O      │-                             │-           │0,01       │
│ 2   4   2       │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│KH PO  3H O      │1,25                          │0,025       │-          │
│  2  4   2       │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│KCO  или (K CO ) │-                             │0,0345      │-          │
│   3       2  3  │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│FeSO  7H O       │0,003                         │-           │-          │
│    4   2        │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│FeCl  6H O       │-                             │-           │0,001      │
│    3   2        │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│Ca(NO )  4H O    │-                             │0,144       │-          │
│     3 2   2     │                              │            │           │
├─────────────────┼──────────────────────────────┼────────────┼───────────┤
│Микроэлементы <*>│по 1 см3 растворов N 1 и N 2  │            │           │
└─────────────────┴──────────────────────────────┴────────────┴───────────┘

    Примечание:  раствор микроэлементов N 1: H BO  - 2,86 г/дм; MnCl 4H O -
                                              3  3                  2  2
1,81  г/дм3; ZnSO 7H O  -  0,222 г/дм3; раствор микроэлементов N 2: MoO   -
                 4  2                                                  3
17,64 мг/дм3; NH VO  - 22,96 мг/дм3.
                4  3

Число клеток в суспензии хлореллы просчитывают в камере Горяева (или любой другой камере для счета водорослей). Кормление дафний проводится 1 раз в день, концентрация корма в сосуде с дафниями 350 - 700 тыс. кл./мл.

Для культивирования рачков удобны небольшие стеклянные кристаллизаторы объемом 1 - 3 дм3, плотность посадки 20 - 25 особей на 1 дм3. Появившуюся молодь в необходимом количестве отсаживают в следующие сосуды от поколения к поколению. Когда вновь народившиеся рачки начинают размножаться, материнские особи удаляют. Каждое поколение маркируют и ставят дату рождения. Одновременно в лаборатории содержат культуры двух поколений дафний.

4.1.4. Проведение исследований на сериях генераций

    Требования   к   тест-объекту.   Для   токсикологических   исследований
используют дафний, начиная с третьего поколения, полученного в лаборатории.
Перед  проведением  эксперимента  оценивают устойчивость рачков к бихромату
калия.   По  величинам  ЛК    за  24  ч  определяют  соответствие  культуры
                          50
стандарту.  Эта  концентрация  для  дафний  в  возрасте  18  +/- 6 ч должна
находиться в пределах 0,9 - 2,0 мг/л.

4.1.4.1. Оценка острой токсичности. Основная цель острых (краткосрочных) опытов на дафниях - установить концентрации исследуемого вещества, которые в водных объектах могут вызвать массовую гибель наиболее продуктивной части зоопланктона - фильтраторов. Кроме того, устанавливается концентрация, начиная с которой следует проводить хронические (длительные) эксперименты.

Острые опыты по оценке токсичности состоят из двух экспериментов - предварительного и основного.

Предварительный эксперимент проводят с набором 3 - 5 концентраций вещества, различающихся в 10 раз. Обычно это 0,001; 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 и 100,0 мг/дм3 вещества. Длительность такого опыта 24 - 48 ч, он позволяет установить порядок остролетальных концентраций веществ.

Основной острый опыт проводится на основании результатов предварительного варианта с набором около 5 концентраций. Выбирают такой диапазон концентраций вещества, которые вызывают иммобилизацию или гибель 10 - 90% рачков. Продолжительность основного острого опыта 48 ч.

В экспериментальные стеклянные стаканы заливают возрастающие объемы исследуемых растворов в количестве по 100 см3 и помещают по 10 односуточных дафний. Повторность опытов в предварительном эксперименте составляет 2 - 3, а в окончательном - не менее трех.

Условия проведения опытов: температура 20 +/- 2 °C, световой день - 10 - 12 ч, вода по своим свойствам должна соответствовать требованиям, перечисленным выше (п. 4.1.3 Приложения 2). В ходе острых опытов рачков не кормят. При работе со стабильными веществами замену растворов не проводят. В случае, когда исследуется быстро распадающееся вещество, исследования проводят с ежедневной заменой растворов.

4.1.4.2. Учет и анализ результатов в острых опытах. В опытах длительностью до четырех суток основным показателем токсичности среды является выживаемость дафний. Наблюдения за выживаемостью дафний проводят непрерывно в течение первого часа воздействия, затем ежечасно в первый день наблюдений и 2 - 3 раза в день - в последующие сроки.

Время гибели рачков отмечают по наступлению неподвижности (иммобилизации), при которой дафнии лежат на дне стакана, плавательные движения отсутствуют и не возобновляются при покачивании стакана. Данные по выживаемости рачков записывают в таблицу по форме 1.

Форма 1

Учет выживаемости дафний в растворах токсиканта А и Б

В качестве дополнительных показателей в остром опыте можно учитывать: изменение окраски тела, кишечника, жирового тела, гонад, изменение наполнения кишечника, а также поведенческие реакции по балльной системе.

Изменения перечисленных показателей нередко предшествуют гибели организмов, что позволяет использовать их для ранней диагностики.

    По   результатам   острых   опытов  определяют  концентрацию  вещества,
                                                                       48
вызывающую  гибель  50%  подопытных организмов за 48 ч экспозиции (ЛК    ).
                                                                     50
Наиболее   простым  и  часто  применяемым  для  определения  ЛК    является
                                                               50
графический  метод. В системе координат по оси ординат откладывают величину
выживаемости  (гибели) дафний в процентах за заданный срок опытов, а по оси
абсцисс  -  логарифм концентрации. Точка пересечения горизонтальной прямой,
соответствующей   50%   выживаемости  рачков,  с  экспериментальной  линией
определит искомую концентрацию ЛК  .
                                 50
    Графически может быть определено также для каждой концентрации вещества
медианное  время  выживания  (ЛВ  ), то есть время выживания 50% организмов
                                50
при данной концентрации.
    Более  точное  определение  ЛК    может  проводиться  с  использованием
                                  50
пробит-анализа (п. 4 Приложения 4).

Результаты опытов дают возможность оценить также наличие острой токсичности по концентрациям, вызывающим достоверное снижение выживаемости рачков по сравнению с контрольными, и определить максимальную концентрацию, при которой острая токсичность не проявляется.

Достоверность получаемых результатов можно считать надежной, если удовлетворены следующие условия:

а) гибель контрольных дафний не превышает 10%;

    б)  ЛК   бихромата  калия  за  24 ч  для  дафний  в возрасте 18 +/- 6 ч
          50
находятся в диапазоне 0,9 - 2,0 мг/л;
    в)  содержание  растворенного  кислорода,  определенное  в конце опыта,
составляет не ниже 2,0 мг O /л.
                           2

4.1.4.3. Оценка токсичности в хроническом эксперименте. Хронические (длительные) опыты с дафниями служат для глубокого, более детального исследования токсичности химических соединений.

    Для   хронических   опытов   подбирают  3 - 4  концентрации   вещества,
составляющие 0,1 - 0,0001 от ЛК   за 48 ч.
                               50

В каждой серии эксперимента (контрольной или опытной) используют не менее 20 рачков, а опыты ставят не менее чем в трех повторностях (приемлемы 4 повторности по 5 дафний или 3 повторности по 7 дафний). В опытные стаканы заливают растворы, исходя из соотношения 50 см3 на 1 дафнию. Возраст рачков 18 +/- 6 ч.

Общие условия (температура, освещенность) проведения хронических опытов те же, что и в острых опытах. Рачков ежедневно кормят хлореллой в концентрации 350 - 700 тыс. кл./см3. Частота замены растворов определяется свойством веществ, но не реже двух раз в неделю. При смене растворов сохраняют соотношение 50 см3 на 1 дафнию, если рачки погибают, количество исследуемого раствора пропорционально уменьшают.

Продолжительность опытов с каждой генерацией определяется временем появления четырех пометов у контрольных дафний, что составляет обычно около 20 суток, а общая продолжительность опытов - 40 - 45 суток.

При проведении опытов на поколениях придерживаются следующей схемы: молодь из первого помета, появившуюся от исходных особей, отсаживают в таком же количестве в растворы вещества с концентрациями, при которых проводились исследования с исходными особями, и ведут такие же наблюдения до получения трех поколений (Таблица 4.1.2).

Таблица 4.1.2

Схема опытов на серии генераций дафний

┌──────────────┬─────────────────────────────────┬────────────────────────┐
│ Оцениваемое  │       Учитываемые пометы        │      Сумма молоди      │
│  поколение   │                                 │                        │
├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤
│Исходное F    │    1      2      3      4       │       1-4              │
│          исх │F    , F    , F    , F           │SUMF                    │
│              │ исх    исх    исх    исх        │    исх                 │
├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤
│Первое F      │  1    2    3    4               │     1-4                │
│        1     │F  , F  , F  , F                 │SUMF                    │
│              │ 1    1    1    1                │    1                   │
├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤
│Второе F      │  1    2    3    4               │     1-4                │
│        2     │F  , F  , F  , F                 │SUMF                    │
│              │ 2    2    2    2                │    2                   │
├──────────────┼─────────────────────────────────┼────────────────────────┤
│Третье F      │  1    2    3    4               │     1-4                │
│        3     │F  , F  , F  , F                 │SUMF                    │
│              │ 3    3    3    3                │    3                   │
└──────────────┴─────────────────────────────────┴────────────────────────┘

Примечание: F - поколения; верхний индекс - пометы каждого поколения; нижний индекс - оцениваемое поколение.

4.1.4.4. Учет и анализ результатов в хроническом опыте. Основными показателями токсического действия являются выживаемость, рост, плодовитость и качество потомства. При наблюдении за размножением рачков учитывают время наступления половозрелости в днях, регистрируемое по моменту откладки яиц в выводковую камеру, время рождения первого помета, количество народившейся молоди в каждом помете. Необходимо учитывать также патологические отклонения: количественный учет абортивных яиц и эмбрионов, мертворожденной и уродливой молоди. В случае появления уродливой молоди ее отсаживают в небольшие сосуды с соответствующими концентрациями исследуемого соединения и наблюдают за ее выживаемостью минимум трое суток.

Наблюдения за выживаемостью и показателями размножения дафний ведут ежедневно, подсчет, анализ и удаление молоди удобно проводить во время смены растворов. Получаемые в ходе опытов результаты регистрируют в таблице согласно форме 2.

Общее количество народившейся жизнеспособной молоди от одной самки отражает величину реальной (фактической) плодовитости дафний.

Форма 2

Изменение биологических показателей
у дафний исходного (1-го, 2-го, 3-го) поколения
при действии исследуемого вещества

Эта величина, в конечном итоге, определяет сохранность вида и имеет решающую роль при оценке токсичности.

Суммарное количество образованных яйцеклеток в организме дафний (патология и фактическая плодовитость) составляет потенциальную плодовитость дафний.

В редких случаях химические вещества могут влиять на темп роста рачков, снижая или увеличивая скорость роста на разных этапах жизни. Из каждой концентрации следует проводить измерение по 10 - 15 рачков после рождения (односуточных), после наступления половозрелости в течение суток и перед окончанием опыта. Измеряют длину рачков от переднего края головы до основания шипа.

По окончании опытов для каждого поколения подсчитывают средние значения выживаемости, плодовитости в пересчете на одну самку за 4 помета, количество патологических отклонений в процентах от реальной плодовитости, от размеров в разные сроки. Результаты опытов в растворах вещества сравнивают с контролем (водная среда без исследуемого вещества), достоверность отклонений результатов опыта от контроля определяют обычными методами вариационной статистики.

Достоверность получаемых результатов в хроническом опыте можно считать надежной, если соблюдены следующие условия:

а) гибель контрольных дафний на конец опыта не превышает 10%;

б) 4 помета у контрольных рачков получены за срок не более 20 +/- 2 суток;

в) количество молоди на 1 самку за 4 помета в контроле - не менее 35 штук;

г) время наступления половозрелости у контрольных рачков - не позднее 9 суток;

    д)  ЛК    бихромата  калия  за 24 ч для дафний из контрольных растворов
          50
находятся в диапазоне 0,9 - 2,0 мг/л.

На основании результатов исследований с дафниями в остром и хроническом опыте делают вывод об уровне токсичности исследуемых веществ.

Определение концентраций, не обладающих хроническим токсическим действием, базируется на оценке трех показателей: выживаемости, плодовитости и размеров дафний. Критерием токсичности в опытах на поколениях рачков служит также наличие статистически достоверного различия трех показателей в опыте и в контроле.

При оценке влияния вещества на размножение особое внимание следует уделить эффекту стимуляции, когда количество молоди в опыте превышает количество в контроле. Опыты на серии трех поколений позволяют установить, насколько устойчив этот эффект в поколениях. Если численность молоди в опыте превышает численность в контроле не более чем на 50 - 70% и не сопровождается патологическими отклонениями в размножении, то стимуляция, как правило, в поколениях не закреплена. Стимулирующий эффект, превышающий 100%, всегда связан с патологическими отклонениями и в ряду поколений приводит к снижению плодовитости.

Число патологических отклонений при развитии у рачков из контрольных серий (чаще всего - абортивные яйца) не должно превышать 10% от величины реальной плодовитости на данный период времени. Появление абортивных яиц может быть связано с ухудшением некоторых условий культивирования: недостатком корма, освещенности, колебанием температуры и качеством воды.

Патологические отклонения, проявляющиеся при исследованиях токсичности вещества, могут указывать на характер действия испытываемого соединения:

а) если у рачков замедлены процессы созревания, снижена численность пометов и количество образованных яйцеклеток, то вещество обладает гонадотропным действием;

б) если у дафний опытной серии величина потенциальной плодовитости равна или превышает контроль, а реальная плодовитость значительно снижена за счет абортивных яиц, эмбрионов и мертворожденной уродливой молоди, то вещество обладает эмбриотропным действием;

в) если у дафний отмечено появление уродливой молоди, которая выживает в исследуемых растворах 3 и более суток, то предполагается наличие мутагенности и необходимо проведение специальных уточняющих экспериментов.

При установлении недействующих концентраций вещества на дафниях лимитирующими показателями, как правило, являются выживаемость и плодовитость. Направленное действие вещества только на размеры дафний наблюдается реже. Химические соединения могут тормозить рост на разных жизненных этапах:

а) если молодь рождается такая же, как в контрольных растворах, но к периоду наступления половозрелости размеры рачков уменьшены, то вещество тормозит рост дафний в ювенильный период;

б) если размеры дафний достоверно уменьшены к концу опытов, то вещество подавляло рост дафний в период размножения;

в) если новорожденная молодь в 2 раза мельче, чем молодь контрольных рачков, то результаты указывают на наличие мутагенного эффекта.

4.1.5.1. Постановка исследований. Опыты по этой схеме проводятся в химических стаканах или аквариумах с объемом среды 1дм3. Остальные приемы сходны с описанными в предыдущей методике. Выметанную молодь после подсчета не удаляют (как в случае постановки опыта на серии генераций), а возвращают в экспериментальный стакан.

В стаканы вносится одинаковое количество одновозрастных рачков (по 8, 9 или 10 организмов). Подсчет удобно производить по трем возрастным группам дафний: молодь до начала созревания гонад (м1), молодь с гонадами, начавшими созревать (м2), и взрослые. Поскольку переход между группами регистрируется нечетко, удобно использовать вторичный половой признак - у м1 первый абдоминальный отросток неразвит или имеет малые размеры и расположен перпендикулярно спине абдомена, у м2 он начинает загибаться вперед.

Полный анализ с использованием шкал можно производить не на всех рачках, а отобрав по 15 экземпляров м1, м2 и взрослых, остальные подсчитывают только для учета соотношения их численности. Затем дафний взвешивают. Для этого следует сделать сито из планктонного газа и капроновой жилки (0,4 - 0,6 мм), используя в качестве шаблона дно химической пробирки соответствующей кривизны и сваривая все части с помощью нагретого железного предмета, например, пинцета с тонкими кончиками и т.п. Для взвешивания рачков из стакана для просмотра пипеткой переносят на сито. В сито для просмотра, помещенное в чашку Петри (где и удобно проводить просмотр), наливают немного воды из стакана, в котором они находились. Сито для взвешивания обсушивают на фильтровальной бумаге. Взвешивание производится на торсионных или аналогичных им других весах, после чего дафний немедленно переносят в новую экспериментальную среду. Взвешивают всех дафний из данной концентрации с точностью +/-1,5 мг, поэтому вес более 10 рачков достаточно репрезентативен.

Опыт длится до начала снижения биомассы после достижения ее максимальной величины в контроле и при низких концентрациях вещества (подострый опыт) или до второго или третьего пика биомассы (хронический опыт).

4.1.5.2. Учет и анализ результатов. В течение первых двух часов наблюдение проводится регулярно: сначала каждую минуту, затем - через 5, далее - через 10 минут. Позже можно ограничиться просмотром через полчаса до конца первого рабочего дня. Со следующего дня просмотр проводится ежедневно.

Через сутки, через двое, на 5-е и 10-е сутки проводится полный анализ с просмотром под бинокуляром и описанием состояния каждой особи. Если имеются данные, что возможна задержка роста дафний, они должны регулярно измеряться под бинокуляром.

Дафнии подразделяются на следующие возрастные группы:

    o м   -  молодые самки до начала созревания гонад (первый абдоминальный
    +  1
отросток не начал отгибаться вперед);
    o м   -   молодые   самки  с  начавшими  развиваться  гонадами  (первый
    +  2
абдоминальный отросток начал отгибаться вперед);
    o ял. -   взрослые   яловые   самки,   у которых в  выводковой   камере
    +
(в марсупии) должны  быть,  но  отсутствуют  зародыши  или  на  спине   нет
эфилпиума;
    o я - взрослые самки с яйцами или зародышами в выводковой камере;
    +
    o яМs  -  самки  с  яйцами  и  зародышами  разного  возраста  и размера
    +
(нарушение развития части яиц);
    o э - самки с эфиппиумом на спине и латентными яйцами в гонадах;
    +
    /\
    o  м  -  молодые самцы до начала развития вторичных признаков, у них, в
        1
отличие  от  самок  того  же  возраста, несколько "бульдожий" вид и вздутые
антеннулы;
    /\
    o м  -  молодые  самцы   с  началом роста антеннул (они вытянуты, но не
       2
развиты полностью) и с образованием расширения на нижней щели раковины;
    /\
    o  -  взрослые  самцы  с  полностью  развитыми антеннулами, с опушенным
расширением  в  середине  брюшной  щели раковины и длинным жгутом на первых
абдоминальных ножках.

Если под влиянием нервно-паралитического яда у дафний происходит судорожное сокращение продольных мышц абдомена, особенно когда это сопровождается опорожнением кишечника и выбрасыванием из выводковой камеры яиц или зародышей, ставят букву "Т" (тетанус). Обязательно отмечают случаи побеления (коагуляции белков), в первую очередь жаберных отростков абдоминальных ножек.

Такие отметки делают при беглом просмотре дафний. При тщательном обследовании под бинокуляром регистрируется численность (2 раза в неделю в момент замены растворов):

                                          /\     /\
    а) молоди м1 и м2 (отдельно oм ; oм ; o м  и o м );
                                + 1  + 2     1      2
                        /\
    б) взрослых самцов (o );
    в) самок с партеногенетическими яйцами (oя);
                                            +
    г)  "яловых" самок (явно половозрелых, но с пустовыводной камерой, если
гонады не набиты партеногенетическими яйцами) (oял.);
                                               +
    д) самок с эфиппиумами (oэ).
                            +

Кроме того, учитываются случаи уродливого развития яиц в выводковой камере, сброшенные недоразвитые яйца и зародыши, сброшенные эфиппиумы (если в них нет латентных яиц) и суммарный вес живых дафний.

    Один-два раза  в  течение  эксперимента, лучше всего на 10 - 15-е сутки
(фаза  логарифмического роста) и при достижении биомассы насыщения (на 25 -
28-е  сутки)  целесообразно  в качестве дополнительных показателей провести
полный  биологический  анализ дафний  с  регистрацией по 15 особей oм , oм
                                                                   + 1  + 2
и взрослых.

Отдельно должны учитываться все уродливые особи. Желательно пересадить их в чистую воду и проследить за их дальнейшей судьбой и за их потомством.

Как правило, наиболее чувствительным показателем является биомасса дафний в момент достижения максимальных значений в контроле и при минимальных концентрациях вещества в опыте. Если обнаруживаются нарушения в развитии партеногенетических или латентных яиц, ПДК вещества должна устанавливаться по этому показателю.

Об упитанности дафний и накоплении гемоглобина при снижении в воде содержания растворенного кислорода можно судить по цвету тела и количеству капель жира. Иногда у дафний появляется зеленовато-голубоватая окраска, особенно яиц и зародышей в выводковой сумке, расположенной между створками раковины на спинной стороне и абдоменом рачка. Обычно этот цвет приписывают каротиноидам, накапливаемым в заметных количествах.

Ниже приведены некоторые формы записи и интерпретации результатов опытов с дафниями (Таблицы 4.1.2 - 4.1.6 и Формы 3 - 5).

При внесении в таблицу в числителе записывают состояние яиц в гонадах, а в знаменателе - состояние яиц, зародышей в выводковой камере или в эфиппиуме на ней. Выделяют следующие градации степени повреждающего действия:

    E  - реакции дафний, не связанные с их повреждением;
     1
    E   -  легкие  повреждения, не связанные с опасностью для существования
     2
особи;
    E  - повреждения средней тяжести;
     3
    E  - тяжелые повреждения;
     4
    E   -  гибель  рачков  и  предшествующие  ей  симптомы  (иммобилизация,
     5
тетанические сокращения туловища, параличи и т.п.).

Таблица 4.1.2

Шкала для оценки степени наполнения кишечника дафний

Примечание: баллы к2а и к3а свидетельствуют о нарушении пищеварения, к1 и к2 - о голодании дафний, к3 - о плохом питании.

Таблица 4.1.3

Сокращенная запись окраски содержимого кишечника

Примечание: заполненность кишечника и окраску его содержимого удобно учитывать отдельно для передней (до перегиба при переходе из головного отдела в абдомен) и задней части.

Таблица 4.1.4

Шкала градаций окраски тела дафний

┌──────────────────────────────────────────────────────────┬──────────────┐
│            Характеристика окраски тела дафний            │Оценочный балл│
├──────────────────────────────────────────────────────────┼──────────────┤
│Бесцветное, "стеклянное"                                  │1             │
├──────────────────────────────────────────────────────────┼──────────────┤
│Желтоватое (полостная жидкость не видна, но ощущается     │2             │
│плазма клеток)                                            │              │
├──────────────────────────────────────────────────────────┼──────────────┤
│Плазма клеток и кровь (полостная жидкость) имеют          │              │
│диффузно-розовое окрашивание:                             │              │
│бледное                                                   │3             │
│умеренное                                                 │4             │
│яркое                                                     │5             │
├──────────────────────────────────────────────────────────┼──────────────┤
│Мутно-желтое                                              │2м            │
├──────────────────────────────────────────────────────────┼──────────────┤
│Мутно-розовое                                             │3м - 5м       │
└──────────────────────────────────────────────────────────┴──────────────┘

Примечание: балл 1м не приводится, поскольку он плохо выявляется визуально. Мутность (в первую очередь дыхательных отростков ног и туловища) обычно свидетельствует о коагуляции плазмы клеток.

Таблица 4.1.5

Шкала развития партеногенетических и латентных яиц
в гонадах дафний

Таблица 4.1.6

Шкала развития партеногенетических яиц в выводковой
камере и эфиппиума. Норма и патология

Форма 3

Выживаемость дафний в растворах вещества

Форма 4

Изменение биологических показателей у дафний
под влиянием вещества

Форма 5

Изменения биологических показателей у дафний
в опытах на культурах