3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для простейших
3. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для простейших 
3.1. Введение
Простейшие, в частности инфузории, составляют до 70% численности гетеротрофного микропланктона в водных объектах. Многочисленность данной группы организмов, экологическая значимость ее в процессах самоочищения, в продукционных процессах, трофических связях, значение ее как составной части естественной кормовой базы зоопланктона и молоди рыб вызывают необходимость исследовать данную группу в токсикологическом плане. Наблюдения показали, что простейшие в силу своих физиологических особенностей проявляют большую чувствительность к изменению факторов внешней среды. Их короткий цикл развития дает возможность проследить действие отдельных веществ на ряде поколений. Данные организмы (особенно ресничные инфузории) достаточно легко культивировать. Все это делает простейших удобным тест-объектом для токсикологических опытов.
3.2. Характеристика тест-объекта
В токсикологических исследованиях в качестве тест-объектов используется парамеция (Paramecium caudatum Ehrenberg) - свободноживущая широко распространенная ресничная инфузория, предпочитающая альфа-мезосапробные условия. Температурный оптимум лежит в пределах 24 - 28 °C, предпочитает pH, близкую к нейтральной (6,5 - 7,5). Основными регистрируемыми показателями являются выживаемость и скорость размножения.
Выбор парамеции в качестве тест-объекта обусловлен следующими критериями. Благодаря сочетанию в парамеции признаков клетки и организма на ней можно изучить как клеточные, так и организменные формы реакции на токсическое воздействие. Возможность культивирования в широком диапазоне температур позволяет использовать их для экспериментальных работ в любое время года.
Короткий жизненный цикл, быстрота размножения позволяют проследить реакцию на интоксикацию в относительно короткий срок в длинном ряду поколений. Используя принцип клонирования, можно получить большое количество генетически однородного материала.
3.3. Условия лабораторного содержания
Парамеций выделяют из природных водных объектов или берут чистые культуры из коллекций. Из природных водных объектов банкой на 1 дм3 у самого берега зачерпывают воду с илом. В тот же день под бинокуляром просматривают пробу.
Обнаруженных парамеций последовательно переносят в микроаквариумы сначала со смесью: природная среда и культуральная среда в соотношении 2:1, затем увеличивают содержание культуральной среды в микроаквариумах через каждый час и, наконец, помещают в чистую культуральную среду.
Монокультуру простейших культивируют при комнатной температуре 20 +/- 2 °C на среде Лозина-Лозинского в чашках Петри при естественном освещении, предохраняя от воздействия прямых солнечных лучей, или в люминостате.
Используется лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:
реактивы для приготовления среды Лозина-Лозинского;
вода дистиллированная;
бумага фильтровальная;
колбы на 1000 см3;
градуированные мерные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 см3;
пипетки для пересадки простейших (Пастеровские пипетки с укороченным концом);
мерные колбы на 100 см3;
мерные пробирки на 10 см3;
чашки Петри;
микроаквариумы (блок камер из оргстекла);
бинокуляр МБС-9 или МБС-10;
pH-метр;
двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия
2 2 7
двухромокислого;
культура простейших (Paramecium caudatum Ehrenberg1838);
сухие пекарские дрожжи.
Состав минеральной среды Лозина-Лозинского для культивирования P.caudatum:
в 1 дм3 дистиллированной воды растворяют:
NaCl - 0,1 г;
KCl - 0,01 г;
CaCl - 0,01 г;
2
MgCl - 0,01 г;
2
NaHCO - 0,02 г.
3
В качестве корма используют хорошо высушенные и измельченные пекарские дрожжи, которые легко хранить в закрытой посуде. Вносят их в чашки Петри в очень небольшом количестве на кончике скальпеля или делают суспензию дрожжей и стерильной пипеткой производят подкормку парамеций из расчета 2 - 3 капли на чашку Петри. Можно в качестве корма использовать (на чашку Петри) частицу дробленого зерна риса.
Два раза в неделю рекомендуется просматривать состояние культуры в чашках Петри. Через две недели культуру пересаживают, т.е. 100 - 300 особей пипеткой переносят в чашку Петри с чистой средой, куда добавляют один из названных видов корма.
Не реже 1 раза в месяц проводят оценку физиологической чувствительности
организмов. Для этого используют эталонное (стандартное) вещество -
двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия
2 2 7
двухромокислого. Готовят маточный раствор двухромокислого калия
концентрацией 1 г/дм3. Далее методом разбавления готовят серию растворов с
концентрациями 100,0; 150,0; 200,0; 250,0 и 300,0 мг/дм3. Исследование
проводят в течение 24 ч. По результатам эксперимента рассчитывают летальную
концентрацию K Cr O , вызывающую гибель простейших на 50% (ЛК за 24 ч).
2 2 7 50
Если полученные значения ЛК находятся в интервале 170 - 220,0 мг/дм3, то
50
культура может быть использована для проведения экспериментов.
Если полученные значения ЛК не попадают в интервал 170 - 220 мг/дм3,
50
эксперименты с простейшими не проводят, выясняют причину этого, эксперимент
повторяют.
3.4. Проведение исследований
Перед постановкой опытов культуру простейших необходимо вывести в экспоненциальную фазу развития, что достигается пересевом культуры за трое суток до постановки опытов в чашку Петри с добавлением корма.
Эксперименты можно проводить как в чашках Петри объемом 25 см3, так и в камерах с рабочим объемом 4 см3. Плотность посадки в чашках Петри (с рабочим объемом 10 мл) 10 организмов, в камерах с рабочим объемом 4 мл - 5 организмов. Повторность - двух- или трехкратная.
Для предварительных и окончательных экспериментов удобно использовать камеры из органического стекла с рабочим объемом 4 см3. Блок камер состоит из двух склеенных между собой пластин размером 20 - 21 x 7 - 8 см. В верхней пластине толщиной около 1 см просверливают отверстия диаметром 3 см. Нижняя пластина толщиной около 0,5 см служит дном. В блоке 12 камер (лунок), которые расположены в два ряда по шесть в каждом. В каждую лунку вносят по 5 парамеций. Пять рядов используют для различных концентраций вещества, а шестой - для контроля. Повторность при этом двухкратная (два ряда лунок в блоке). Сверху микроаквариум закрывают стеклянной пластинкой соответствующего размера, что препятствует испарению раствора.
В качестве показателей токсического действия целесообразно использовать выживаемость и темп деления простейших.
В первом случае в камерах из органического стекла (объем 4 см3)
определяют концентрации вещества, вызывающие гибель (LC , LC , LC ) или
16 50 100
любое повреждающее действие (EC , EC , EC ) подопытных организмов за
16 50 100
определенный срок. Длительность опыта определяется токсичностью среды и
составляет обычно от нескольких часов до 5 суток. Контролем служит
культуральная среда. Наблюдения проводят под бинокуляром каждые сутки.
Эксперименты на простейших проводят в два этапа (предварительный и
окончательный). В предварительном эксперименте находят интервал токсических
концентраций. Опыты ставят в широком диапазоне концентраций вещества,
причем предыдущую концентрацию последовательно увеличивают в 10 раз (0,1;
1,0; 10,0 и т.д.). В окончательном эксперименте, установив диапазон
действия вещества, разбивают найденный интервал на пять равных концентраций
и устанавливают ЛК .
50
Темп деления простейших определяют в микроаквариумах (планшет с ячейками (лунки диаметром 1 см, глубина 0,5 см). Планшет с микроаквариумами представляет собой стеклянный или изготовленный из оргстекла квадратный или прямоугольный брусок толщиной 1 см с пятью рядами полированных лунок. В каждом ряду, соответственно, 5 или 10 лунок. Микроаквариумы накрывают стеклянной пластинкой, предохраняя испарение среды из лунок.
Лунки в каждом ряду (5 - 10 лунок) заполняются раствором вещества определенной концентрации. В каждую лунку микроаквариума помещают по одному организму. Ежесуточно в течение нескольких суток (3 - 5 суток) подсчитывают количество организмов в каждой лунке каждого ряда, оставляя, после подсчета организмов, в лунке исходное количество организмов (1 экземпляр), удаляя лишние организмы. Или можно по одному организму переносить в соответствующую лунку с теми же концентрациями вещества аналогичного планшета с микроаквариумами.
3.5. Учет и анализ результатов
В качестве показателя действия токсикантов на тест-объект используют
показатель выживаемости инфузорий за определенный срок наблюдения или
нарушение темпа деления клеток инфузорий, которое выражается в изменении
прироста численности клеток в проценте от контроля. Прирост численности
организмов оценивают по формуле: N = N - N , где N - численность
t o t
организмов в конце опыта (или последующие сутки подсчета), а N -
o
численность организмов в начале опыта (или предыдущие сутки подсчета).
Результаты обрабатывают методами статистики.
