2.11.2. Колориметрический метод определения стеролов (по Либерману-Бурхарду)
2.11.2. Колориметрический метод
определения стеролов (по Либерману-Бурхарду) 
Метод основан на взаимодействии хлороформного раствора холестерола с уксусным ангидридом и серной кислотой, вследствие чего появляется сине-зеленое окрашивание (реакция Либермана-Бурхарда). Помимо холестерола, реакцию Либермана-Бурхарда дают многие стеролы, в том числе эргостерол и ситостерол. Ненасыщенные стеролы реагируют быстрее насыщенных.
Окрашенные продукты определяют фотометрически.
Аппаратура, материалы, реактивы. Фотоэлектроколориметр или спектрофотометр СФ-4А; штатив для пробирок; весы лабораторные; баня водяная; термометр на 100 °C; чашки фарфоровые диаметром 50 - 70 мм; мерная колба 50 куб. см (с притертой пробкой); пробирки емкостью 10 куб. см с пробками; колба коническая вместимостью 100 куб. см (с притертой пробкой); воронки диаметром 5 - 10 см; хлороформ; уксусный ангидрид; серная кислота концентрированная; сульфат натрия безводный; прокаленный песок; ацетон.
Проведение испытания. Навеску средней пробы изделия (10 г) растирают в фарфоровой чашке с прокаленным песком и подсушивают в сушильном шкафу при 100 - 105 °C в течение 20 - 25 мин. Высушенную пробу растирают пестиком и количественно переносят 20 куб. см хлороформа в коническую емкость 100 куб. см для экстракции. В изделиях с малой влажностью навеску, растертую с песком, сразу переводят в коническую колбу, куда добавляют 1 г безводного сульфата натрия и 20 куб. см хлороформа. Колбу закрывают пробкой с термометром и экстрагируют стеролы в течение 5 мин. на водяной бане при 60 - 65 °C. Вытяжку фильтруют через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 50 куб. см. Экстракцию повторяют трижды, беря каждый раз по 10 куб. см хлороформа. Общий объем хлороформного экстракта должен составлять 50 куб. см.
Экстракцию стеролов из теста проводят следующим образом: навеску 15 - 17 г растворяют в фарфоровой чашке с песком и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °C. Высушенную пробу растирают до состояния муки и экстрагируют ацетоном. Из экстракта отгоняют растворитель, осадок подсушивают и растворяют в хлороформе, доводя объем последнего до 100 куб. см.
В три пробирки с притертыми пробками отбирают по 2,5 куб. см экстракта, добавляют по 1 куб. см уксусного ангидрида и нагревают на водяной бане при температуре 55 - 60 °C 10 мин. Затем к смеси добавляют по 4 капли концентрированной серной кислоты, нагревают 15 мин. при температуре 32 - 35 °C и определяют оптическую плотность исследуемого раствора против хлороформа в фотоэлектроколориметре или в спектрофотометре при длине волны 630 нм (кювета 5 мм).
Количество стеролов в исследуемом изделии определяют по формуле:
a x 50 x в
Х = ---------- = 2 x a x в, (69)
10 x 2,5
где:
Х - количество стеролов в изделии, мг;
a - количество холестерола, найденное по калибровочной кривой, мг;
в - масса изделия, г;
10 - масса навески, г;
50 - объем хлороформной вытяжки, куб. см;
2,5 - объем хлороформной вытяжки, взятый для определения, куб. см.
Калибровочную кривую строят по чистому кристаллическому холестеролу, для чего 10 мг его растворяют в перегнанном хлороформе в мерной колбе вместимостью 100 куб. см. Из основного раствора отбирают в пробирки микропипеткой по 0,1; 0,3 и 0,5 куб. см и добавляют к ним соответственно по 2,4; 2,2 и 2,0 куб. см хлороформа. С каждым раствором проводят цветную реакцию и замеряют оптическую плотность приготовленных растворов.
Калибровочную кривую строят в координатах: оптическая плотность - содержание холестерола (мг).
Количество яиц, вложенных в изделие, рассчитывают исходя из того, что в среднем в одном яйце содержится 240 мг холестерола (реакцию Либермана-Бурхарда дают как свободные, так и связанные стеролы), тогда количество вложенных яиц (У) можно рассчитать по формуле:
А - В
У = -----, (70)
240
где:
А - найденное количество стеролов, мг;
В - количество стеролов в сырьевом наборе (кроме яиц), мг.
Величину В находят расчетным путем или экспериментально. Среднее содержание стеролов (свободных и связанных) в муке принимают равным 380 мг/кг.
