7. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для рыб
7.1. Вводные замечания
При оценке действия веществ на ихтиофауну эксперименты проводят на икре, личинках, мальках, сеголетках (годовиках) или взрослых половозрелых рыбах.
Однако, в отличие от пресноводных рыб, в настоящее время отсутствуют культивируемые морские рыбы, удобные для проведения опытов на всех этапах раннего онтогенеза (от эмбрионов до сеголетков). На рыбоводных заводах икра проходных и полупроходных рыб, их личинки, мальки и более старшая молодь до определенного времени развиваются в пресной воде.
В настоящее время икру, развивающуюся в морской среде, рекомендуется получать во время нереста рыб непосредственно в водоеме или в лабораторных условиях. Оплодотворение икры в лаборатории производят сухим или мокрым способом в зависимости от вида рыб и конкретных условий проведения экспериментов. Получение морской молоди и взрослых рыб, особенно их транспортировка и содержание в искусственных условиях весьма затруднительны и требуют дополнительных исследований по доработке соответствующих методик.
Наиболее удобным и весьма чувствительным тест-объектом является хорошо изученная в токсикологическом плане культивируемая в искусственных условиях морская культура - гуппи. Исследования на ее особях в возрасте 1 - 2 суток в остром эксперименте (96 ч) условно можно рассматривать как ответную реакцию личинок рыб на токсическое воздействие. Высокая чувствительность гуппи сохраняется на протяжении первых 4 суток, затем их чувствительность к химическим веществам несколько снижается, но остается на уровне для достоверных отклонений. Кроме того, эксперименты, проведенные на половозрелых особях морской лабораторной культуры гуппи, позволяют не только всесторонне оценить на достоверно однородном материале воздействие химических веществ на старшие возрастные группы рыб, но и использовать более широкий, чем при работе с природными (дикими) популяциями, спектр исследуемых параметров, в частности, показатели реальной плодовитости и жизнестойкости выметанной молоди, характеризующие основополагающий и наиболее чувствительный репродуктивный период.
В настоящее время при токсикологических исследованиях на рыбах рекомендуются следующие тест-объекты: морская лабораторная культура гуппи; рыбы из природного водоема, например, смарида - Черноморский регион; сельдь, навага (икра, личинки), треска (молодь), морская камбала (икра, половозрелые рыбы), семга (смолты) - Северный регион; кутум (икра), бычок кругляк (2 - 3 года), вобла (2 - 3 года) - Каспийский регион; анчоус, минтай, камбаловые (личинки); кета, горбуша (молодь); камбала, красноперка (половозрелые рыбы) - Дальневосточный регион.
При кратковременном исследовании (острые опыты до 96 ч) определяется острое токсическое действие тестируемых растворов веществ на рыб по показателю "выживаемость". Показатель токсичности вещества - снижение выживаемости рыб на 50% за период от 24 до 96 ч.
При длительном исследовании (хронические опыты до 30 суток) - устанавливается достоверное по сравнению с контролем изменение поведенческих реакций, снижение выживаемости, изменение гематологических, патоморфологических и других показателей жизнедеятельности организмов.
7.2. Гуппи
7.2.1. Характеристика тест-объекта
Гуппи (Poecilia reticulata Peters) - широко распространенная аквариумная живородящая рыбка. В природе встречается в соленых и пресных водах. Выдерживает значительные колебания солености.
Данный тест-объект широко применяется в международных и национальных стандартах при токсикологических исследованиях морей и внутренних морских вод.
Гуппи - мелкие рыбы с ярко выраженным половым деморфизмом. Самцы (3 - 4 см) обычно мельче самок и окрашены в более яркие цвета. В их окраске преобладают серовато-коричниевые тона с очень яркими красными, голубыми, зелеными и черными вкраплениями и точками. Самки достигают 6 см в длину, обычно желтовато-зеленые.
Гуппи выдерживают многократное близкородственное скрещивание, что облегчает получение чистых линий.
Для исследований используют гуппи, адаптированных к различной солености. Изменение солености от 0 до 20 промилле гуппи переносят без адаптации. Постепенная адаптация к океанической солености до 35 промилле занимает около двух недель.
7.2.2. Условия лабораторного содержания
Для содержания (культивирования) гуппи используют термостатированные аквариумы, обеспечивающие плотность посадки тест-объектов из расчета для молоди 1 экземпляр на 1 - 2 дм3, и для половозрелых рыб - 1 экземпляр на 5 дм3 воды. Аквариум размещают в помещении, не содержащем токсических паров или газов, заполняют отстоянной и проаэрированной в течение 7 суток морской водой необходимой солености. Искусственная морская вода для содержания гуппи должна отвечать следующим требованиям: pH 7,8 - 8,2, температура 25 - 27 °C. Воду в аквариуме аэрируют с помощью микрокомпрессоров. Каждые три дня часть воды (1/4 - 1/5 часть) заменяют свежей. Поддерживают первоначальный объем воды в аквариумах, доливая дистиллированную воду вместо испарившейся и контролируя соленость с помощью солемера. Ил со дна аквариума убирают регулярно при помощи сифона.
Кроме рыб в аквариум помещают зеленую водоросль энтероморфу, которая при хорошем освещении хорошо развивается и служит для гуппи укрытием и кормом.
Кормят гуппи 1 - 2 раза в сутки, производителей чаще, сухим (дафнии, циклопы) или живым кормом (мотыль, трубочник, дафнии, циклопы). Корм вносят в таком количестве, чтобы рыбы съедали его без остатка за 3 - 5 минут, так как излишки приводят к ухудшению качества воды в аквариуме. Особенно осторожно следует кормить рыб живыми дафниями и циклопами, которые в морской воде быстро погибают и могут служить источником сильного загрязнения.
Для получения молоди отбирают производителей в возрасте от 1 - 2 лет (продолжительность жизни гуппи в аквариумных условиях 3 - 3,5 года).
Самку готовят к вымету, помещая в отдельную термостатированную нерестовую емкость объемом не менее 4 дм3, заполненную водопроводной водой температурой 25 °C и большим количеством мелколистных растений. Готовность самки к вымету мальков определяют по наличию хорошо заметного темного пятна перед анальным плавником. При этом форма брюшка приближается к прямоугольной, и оно становится намного шире спины. Вымет происходит в искусственную или природную морскую воду (самок перед выметом переводят в аквариумы с морской водой).
После окончания вымета самок изолируют, так как они поедают потомство.
Мальки рождаются сформированными. Лучшим кормом для них является "пыль", состоящая из инфузорий, коловраток, молоди ветвистоусых рачков и науплиусов веслоногих рачков. При отсутствии "пыли" молодь гуппи кормят перетертыми сухими дафниями или любым другим измельченным сухим кормом. На 100 мальков вносят не более 1 г корма. По мере роста в рацион рыб вводят измельченный трубочник, мотыль, коретку и другой живой корм. Однодневных и двухнедельных мальков кормят до 5 раз в сутки, более взрослых 2 - 3 раза. Вносимые порции корма должны быть небольшими и поедаться рыбами в течение 3 - 5 минут.
Мальков сортируют по размерам и постепенно переводят из нерестовых аквариумов в вырастные (вначале объемом 50 дм3, а затем - 200 дм3). Мальки становятся половозрелыми в 4 - 6 месяцев.
Гуппи размножаются и растут при солености воды от 0 до 20 промилле без адаптации при их пересаживании. Для тестирования химических веществ в среде с соленостью выше 20 промилле получают исходный материал (мальков) в пресной воде (или в воде с соленостью до 20 промилле) с последующей адаптацией к более высокой солености.
7.2.3. Проведение исследований с гуппи возрастом 1 сутки
В опыте используют гуппи возрастом 1 сутки. Исследования проводят при
освещении рассеянным светом, с естественной сменой дня и ночи,
концентрацией кислорода в воде не менее 4 мг/дм3 и температурой воды
25 +/- 2 °C. Гибель рыбы в контроле не должна превышать 10%. Диапазон
ответной реакции гуппи возрастом 1 - 2 суток (ЛК за 96 часов) на
50
эталонное вещество K Cr O находится в интервале 45 - 60 мг/л.
2 2 7
В аквариум наливают по 10 дм3 контрольной или тестируемой воды. Повторность трехкратная. В каждый аквариум помещают по 10 рыб. Воду в контрольных и опытных аквариумах аэрируют с помощью микрокомпрессоров. Ежесуточно в каждом аквариуме подсчитывают количество выживших рыб и удаляют погибших. Погибшими считают рыб, не подающих признаков движения или дыхания в течение 5 минут после прикосновения к ним стеклянной палочкой.
Для определения наличия острого токсического действия раствора вещества опыт проводят в течение 96 ч. Для определения наличия хронического токсического действия раствора вещества опыт проводят в течение 30 суток.
При кратковременном исследовании рыб не кормят.
При длительном исследовании смену воды в контрольных и опытных аквариумах проводят через 2 суток (или в соответствии со стабильностью тестируемого вещества в воде), один-два раза в сутки рыб кормят.
7.2.4. Определение влияния веществ на реальную плодовитость гуппи
При необходимости, для изучения влияния тестируемого вещества на реальную плодовитость гуппи, предварительно проводится подготовка тест-объекта.
Полученных от производителей мальков в течение 1 месяца выращивают в просторном аквариуме (на 1 малька - 1 дм3 воды). С появлением первых признаков половых различий, самцов отделяют от самок и продолжают выращивать в отдельных аквариумах. При температуре 25 - 27 °C через 6 месяцев все рыбы становятся половозрелыми. С этого момента их можно использовать в опыте.
За три дня до начала постановки опытов самцов и самок помещают в общий аквариум для спаривания. Соотношение самцов и самок 2:1. Однажды оплодотворенная самка может приносить приплод несколько раз.
Опыт длится до 30 суток. За это время при температуре 25 - 27 °C все самки рожают мальков.
Опыт проводят в трех повторностях. В каждый аквариум помещают по шесть самок. В процессе эксперимента рыб кормят живым кормом. В аквариумах устанавливаются садки с крупными ячейками, чтобы исключить поедание самками новорожденной молоди.
Показателем токсичности тестируемого раствора вещества служат выживаемость самок, реальная плодовитость (количество жизнеспособной молоди), количество мертворожденной молоди по сравнению с контролем.
Жизнеспособную молодь желательно проверить по показателю ЛК для
50
K Cr O .
2 2 7
7.3. Эмбрионы и личинки
7.3.1. Икра и личинки беломорских рыб
В качестве тест-объекта используется икра и выклюнувшиеся личинки (апрель) беломорской сельди или (январь) наваги.
Продолжительность эксперимента 33 суток для сельди и 74 суток для наваги (от оплодотворения до перехода личинок на экзогенное питание).
Основными критериями оценки токсичности препарата служат: процент оплодотворения икры, выживаемость икры и личинок, скорость эмбриогенеза от этапа дробления до этапа вылупления, динамика выклева, аномалии в развитии.
Оплодотворение икры проводят "мокрым" способом в чистой морской среде и в заранее приготовленных исследуемых растворах. Субстратом для икринок беломорской сельди служат предметные стекла, помещаемые в чашки Петри. После набухания икры с предметных стекол под бинокуляром с помощью глазного скальпеля удаляют комки и слипшиеся икринки, оставляя на стекле до 30 - 50 икринок. Икра наваги неклейкая и легко раскладывается по чашкам Петри. Процент оплодотворения икры рыб составляет 98 - 99%. Во всех вариантах опыта и в контроле используется икра от одной самки (соотношение самок и самцов при оплодотворении 1:2).
Эксперименты ставят в чашках Петри со сменой растворов один раз в неделю (или в соответствии со стабильностью исследуемых препаратов). Величина выборки в каждом варианте составляет суммарно по трем повторностям от 120 до 160 икринок.
В качестве фоновой среды в опыте и в контроле используют природную морскую воду, привезенную с места оплодотворения икры. Для наваги соленость воды должна быть не ниже 20 промилле.
Температурный режим обеспечивается с помощью термостатирующих лотков. В эмбриональный период температура поддерживается на уровне 3 - 4 °C для сельди, 1,5 °C для наваги. С начала выклева личинок сельди, в соответствии с биологией тест-объекта, температура постепенно поднимается до 11 °C.
Проводится статистическая обработка полученного материала. Достоверность различий средних данных в опыте от контроля оценивается по критерию Стьюдента для уровня значимости 95% (P >= 0,05). Рассчитываются параметры токсичности.
7.3.2. Исследования на икре и личинках дальневосточных рыб
В водном объекте отлавливают планктонную икру массовых морских видов рыб (анчоус, камбала, минтай) и переносят в лабораторные условия. Инкубацию икры проводят в лабораторных условиях, при этом предличинки сразу попадают в искусственно созданные условия обитания, что исключает необходимость периода адаптации. В эксперименте сравнивают выживаемость предличинок в тестируемых растворах вещества и контроле. Длительность экспериментов с предличинками разных рыб от 96 ч до 10 суток (время рассасывания желточного мешка).
7.3.2.1. Анчоус японский (Engraulis japonicus)
Икра у японского анчоуса пелагическая, свободно плавающая, эллиптическая, с большим диаметром - около 1,25 мм и малым диаметром - около 0,9 мм. Оболочка тонкая, прозрачная. Размеры икринок отрицательно коррелируют с температурой воды, при которой идет нерест, - чем выше температура, тем меньше размер икры.
Продолжительность развития эмбрионов (до выклева) при средней температуре 18 °C составляет 48 ч. При температуре 14 °C развитие эбрионов происходит до 103 ч, при 26 °C - до 23 ч (Камия Н. Пелагическая икра и личинки рыб в заливе Татеяма. Научные доклады (известия) Тихоокеанского хозяйственного института. Т. 11, 1916 г.).
Форма предличинок каплевидная, по мере рассасывания желточного мешка их тело приобретает нитевидную форму. Как у всех сельдеобразных, личинки анчоуса почти прозрачные, пигментация в виде меланофоров располагается на брюшной стороне тела и сохраняется вплоть до фазы оформившегося малька. В заливе Петра Великого длина тела для только что выклюнувшихся личинок составляет 2,4 мм до конца уростиля. Для личинок в возрасте 4 - 5 дней (период рассасывания желточного мешка) - 2,8 - 3,8 мм.
7.3.2.2. Желтоперая камбала (Limanda aspera).
Икра пелагическая, свободно плавающая. Диаметр икринок варьирует от 0,72 до 0,98 мм.
Развитие эмбриона в зависимости от температуры продолжается 4 - 6 дней. Предличинки практически прозрачные, каплевидные из-за сильного смещения к голове желточного мешка. Личинки становятся мальками на 10-й день после выклева.
7.3.2.3. Длиннорылая камбала (Limanda punctatissima punctatissima).
Икра пелагическая, свободноплавающая.
Оплодотворенные икринки совершенно прозрачные и с трудом различимы в воде. Диаметр оплодотворенных и разбухших в воде икринок колеблется от 0,71 до 0,85 мм, составляя в среднем 0,74 - 0,80 мм. Это самые мелкие из всех встречающихся одновременно с ними видов икринок. На первых стадиях развития трудно отделить икринки длиннорылой камбалы от близких к ним по размерам икринок желтоперой камбалы. С конца же II стадии разделение икринок этих двух видов не представляет труда по пигменту в виде рассеянных точек, распространенных почти по всему телу эмбриона, кроме хвостовой части. Глаза в течение всего эмбрионального развития остаются непигментированными (Перцева-Остроумова Т.А. Размножение и развитие дальневосточных камбал. М.: АН СССР, 1961).
Выклюнувшиеся предличинки прозрачны и очень малы. Это самые мелкие предличинки из всех видов дальневосточных камбал. В среднем длина живых предличинок равна 2,32 мм и колеблется от 2,21 до 2,50 мм. На хвостовом стебле у предличинок этого вида ярко выражен поясок из черных и желтых пигментных клеток, что хорошо отличает их от предличинок близкородственных видов. На четвертые сутки предличинки почти полностью утрачивают желточный мешок, их длина в это время составляет в среднем 3,2 мм.
7.3.2.4. Минтай (Theragra chalcogramma).
Икринки минтая пелагические, имеют шаровидную форму, совершенно прозрачны. Они держатся в самом верхнем слое воды. Диаметр в среднем равен 1,4 - 1,7 мм. Оболочка икринок тонкая, но очень плотная. При температуре воды ниже -1 °C развитие эмбриона приостанавливается, но он не погибает даже при вмерзании икринки в лед. Верхний температурный предел жизнеспособности икры минтая экспериментально определен в 15 °C. Вывод о более высокой выживаемости икры минтая при низких положительных температурах (в пределах Японии 2 - 4 °C) подтвержден и другими исследователями. Экспериментально показан также низкий выклев при температуре -1 и 13 °C. На континентальном шельфе нерест минтая протекает в придонных слоях в темное время суток. Икра после вымета всплывает в верхние слои моря, где происходит ее развитие. По мере развития она постепенно опускается в более низкие горизонты. За 10 - 30 ч до вылупления личинок, икра опять поднимается в средние слои. Продолжительность эмбрионального развития минтая составляет 93 градусо-дня (Горбунова Н.Н. Икра минтая и ее развитие. Владивосток: Известия ТИНРО. т. 34, 1951).
Только что вылупившиеся личинки снабжены большим желточным мешком, длина их составляет 3 - 4,6 мм, в среднем около 4 мм.
7.3.1. Условия лабораторного содержания дальневосточных предличинок рыб. Проведение исследований
Икра анчоуса и камбал на I - XI стадиях отлавливается днем из поверхностного слоя с помощью нестандартного орудия лова, изготовленного по типу сети Маручи-Ами с диаметром входного отверстия 1,3 м. Доинкубирование икры осуществляют при температуре 14 - 21 °C.
Работы с икрой и предличинками необходимо проводить в хорошо освещенных аквариальных помещениях, где не используются летучие химические вещества. Стабильные температурные условия обеспечивают с помощью термостатируемых аквариумов. Вылупившихся предличинок рассаживают пипеткой в экспериментальные емкости по 5 экземпляров на 100 см3 отстоянной и отфильтрованной через тройной слой газа N 61 морской воды с соленостью 33 промилле.
В эксперименте оценивается выживаемость личинок, которая является интегральной характеристикой резистентности организмов. Смертность в различных сериях острых экспериментов подсчитывают через 12 ч в течение всего опыта.
Опыты на предличинках анчоуса и камбал проводят в стеклянных стаканах с объемом растворов 100 см3. В каждый сосуд помещают по 5 особей. Для снижения гибели в контроле и улучшения воспроизводимости результатов, предличинок рассаживают через 12 ч после их выклева (возраст 14 - 22 ч). Незначительные изменения температуры воды в опыте и контроле соответствуют природному ходу температур. Освещенность повторяет естественные суточные циклы. Продолжительность экспозиции в экспериментах на предличинках анчоуса и камбал составляет 96 часов. За это время при температуре 18 °C происходит рассасывание желточного мешка.
При необходимости проводят предварительные эксперименты, на их основании устанавливают диапазон токсичных концентраций для основного опыта, состоящий из четырех-пяти концентраций вещества. При этом следует стремиться к тому, чтобы, по крайней мере, по одной концентрации вызывали эффект менее 50% и более 50%.
Опыты проводятся в трех повторностях. Параллельно ставится тройной контроль, с соблюдением тех же условий, что и в опыте: организмы берутся из той же партии, вода та же, но без внесения исследуемого вещества. В течение 96 ч эксперимента среду содержания не заменяют, предличинок не кормят.
При проведении токсикологических опытов регистрируют следующие показатели по сравнению с контролем:
а) основные: выживаемость, процент уродливых особей;
б) дополнительные: внешний вид, поведенческие реакции (снижение двигательной активности, оседание на дно).
По окончании опытов проводят подсчет погибших особей с учетом "поправки
Аббота" (п. 1.3 Приложения 4 настоящих Методических указаний) и расчет
параметров токсичности - ЛК , ЛК , ЛК , ЛК , ЛК .
0 16 50 84 100
Показателем токсичности является достоверное снижение выживаемости и наличия уродливых особей. Опыт считается достоверным, если гибель в контроле не превышает 10%.
7.4. Мальки и взрослые рыбы
Для исследований используют рыб морских видов, легко адаптирующихся к аквариальным условиям. Например, молодь кеты, горбуши; сеголеток и рыб более старших возрастных групп - красноперки, камбалы, наваги, сельди.
Для этого отлавливают молодь или взрослых особей из водного объекта. Рыб транспортируют на специально оборудованном транспорте с регулируемой подачей кислорода. При длительных перевозках необходим постоянный контроль за кислородным режимом и температурой воды, так как при резких перепадах данных показателей возможен значительный отход (гибель) перевозимой рыбы. При кратковременных перевозках можно использовать молочные бидоны или полиэтиленовые мешки, не допуская травмирования и резкого снижения содержания кислорода в воде.
7.4.1. Условия лабораторного содержания рыб из природного водного объекта
В аквариальных условиях привезенную рыбу помещают в приготовленную заранее отстоянную профильтрованную природную морскую воду (pH 7,8 - 8,5), при постоянном контроле растворенного в воде кислорода (от 8,5 до 9,5 мг/л), поддерживаемого за счет аэрации.
Емкости, в которых содержится рыба, должны быть оборудованы биофильтрами, а вода в них должна периодически обновляться за счет частичной замены не реже одного раза в 10 суток и полной замены не реже одного раза в месяц.
Срок адаптации рыб к условиям аквариальной не менее 10 суток.
Плотность посадки не должна превышать 1 г ихтиомассы мальков и 2 г взрослых рыб на 1 дм3 воды.
Для кормления рыб используют специальные пастообразные, гранулированные или живые корма, которые задают по мере его съедания, но не реже двух раз в сутки для мальков (утром и вечером) и один раз для рыб более старшего возраста.
Для проведения исследований необходимы следующее оборудование, приборы и материалы:
стеллажи;
емкости на 10, 20, 40, 60, 100, 200, 500, 1000 и 2000 л;
холодильные установки для хранения корма и реактивов;
весы аналитические с разновесами;
весы аптекарские (чашечные и ручные);
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
электромешалка;
вентиляторы или кондиционер;
ведра эмалированные;
бидоны, ведра эмалированные, тазы и кюветы разных размеров;
фотоаппарат;
сачки разноячейные;
материал из мелкоячейной сети, газа или дели для емкостей с рыбой;
микрокомпрессоры;
аквариумные водонагреватели с датчиками;
скальпели, пинцеты, ножницы, шприцы на 1 - 20 мл, препаровальные иглы;
секундомер;
линейки;
набор приборов, инструментов и реактивов для исследования крови; гистологических и биохимических исследований;
стеклянная посуда емкостью от 0,1 до 3 л, мерные пипетки, глазные пипетки, бюретки, мерные стаканы, колбы, чашки Петри, стеклянные трубки и палочки;
резиновые шланги разного диаметра и длины, резиновые груши;
полиэтиленовая пленка, клеенка, марля, халаты, резиновые фартуки, сапоги и перчатки;
карандаши по стеклу, лейкопластырь, фиксирующие и дезинфицирующие жидкости.
7.4.2. Проведение исследований
Для исследований отбирают одноразмерные экземпляры рыб в хорошем физиологическом состоянии.
Перед началом экспериментов рыб помещают в аквариумы или другие
экспериментальные емкости на 7 - 10 суток с целью адаптации к новым
условиям. В острых опытах длительностью 96 ч проводят определения ЛК , ЛК
0 50
96
и ЛК . Хронические опыты начинают с концентрации, равной 1/2 ЛК , и
100 50
создают токсикологический ряд из 5 - 10 убывающих концентраций вещества с
множителем 1/2. Длительность хронических опытов составляет 1 - 3 месяца в
зависимости от стабильности исследуемого вещества в воде.
Эксперименты проводят в стеклянных аквариумах или пластмассовых ваннах емкостью 20 - 40 дм3 в двукратной повторности с использованием 5 - 10 особей в каждой концентрации вещества. Два аквариума служат контролем.
Норма посадки мальков, сеголетков и годовиков лососевых и сиговых рыб в экспериментальные емкости для проведения опытов должна быть не более 1 г ихтиомассы на 1 л воды в сутки. Для рыб возрастом более года эта величина составляет не более 3 г на 1 дм3 воды в сутки.
Взвешивание рыб производят перед началом опыта, затем через каждые 10 - 15 суток до его окончания. Для этого на весы ставят сосуд емкостью 2 - 2,5 дм3, в который наливают 0,5 - 1 дм3 воды, и уравновешивают его с помощью гирь или другого сосуда с водой. Затем отловленных сачком рыб быстро помещают в сосуд с водой для взвешивания, предварительно осушив низ сачка от избытка влаги марлей. Мальков взвешивают с помощью химических стаканов на аптекарских или других более точных весах.
В экспериментальных емкостях ежедневно измеряют температуру воды и один раз в 10 суток проводят определение содержания растворенного в воде кислорода и pH.
В зависимости от стабильности исследуемого вещества смену воды в опытных емкостях проводят один раз в 1 - 3 суток, спустя 1,5 - 2 ч после кормления рыб. При этом недопустимо травмирование рыб. Аэрация воды возможна лишь в тех случаях, когда состав и концентрация исследуемого вещества не изменяются. Толщина слоя воды в аквариуме для сеголетков и годовиков должна быть не менее 20 см, для более крупных рыб ее следует увеличивать.
Схема и динамика проведения опытов, учет регистрируемых показателей отражаются в лабораторном журнале.
Опыты по определению параметров острой и хронической токсичности веществ, установления коэффициентов кумуляции проводят на мальках или сеголетках. Ставят также острые и хронические опыты на сеголетках или двухлетках для определения их токсичности по физиолого-гистологическим, гематологическим показателям, используя среднелетальные, максимально переносимые и более низкие концентрации для установления пороговых.
7.4.3. Учет и анализ результатов приводят в п. 6.2.4 Приложения 2
8. Оценка генотоксичности вещества проводится в соответствии с п. 7 (п. 7.1; п. 7.2; п. 7.3 (пп. 7.3.1); п. 7.4; п. 7.6) Приложения 2 настоящих Методических указаний).
9. Определение требований к оценке временных нормативов вещества для объектов рыбохозяйственного значения морей и внутренних морских вод Российской Федерации.
9.1. Исследование на водорослях
Рекомендуется проведение семисуточных исследований действия вещества на рост культуры водорослей (п. 1.4 Приложения 3 настоящих Методических указаний, а также требования проведения хронического эксперимента (Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методом биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002). В качестве альтернативы возможно полное проведение хронического эксперимента с одноклеточными водорослями в течение 14 - 21 суток.
В конце опытов оценивается статистическая достоверность отклонений опытных данных от контрольных.
Условия культивирования водорослей и постановки токсикологических исследований с ними приведены в п. 1 Приложения 3 данных Методических указаний.
9.2. Исследование на зоопланктонных организмах
Исследования проводятся на односуточных артемиях в течение 7 суток (неполный хронический эксперимент). После семисуточного опыта, как правило, не наблюдается резкого увеличения гибели артемий в эксперименте длительностью 21 суток. В качестве альтернативы возможно полное проведение хронического эксперимента в течение 21 суток.
Постановка токсикологических исследований изложена в п. 5 Приложения 3 данных Методических указаний.
9.3. Исследование на рыбах
Условия получения, содержания икринок и проведения исследований на них при инкубации до 30 - 45 суток в настоящее время не дают возможности проводить краткосрочные эксперименты с икрой морских рыб.
В то же время достаточно большое количество токсикологических исследований показывает чувствительность морской культуры гуппи (односуточные организмы) на уровне или на порядок выше ответной реакции эмбрионального развития морских рыб на загрязняющее вещество. Это позволяет рекомендовать острые опыты (96 ч) с использованием в качестве тест-объекта односуточных гуппи. Условия проведения экспериментов в п. 7 Приложения 3 данных Методических указаний.
Анализ результатов исследований показал, что в качестве максимально допустимой концентрации для рыб принимается максимальная концентрация, не вызывающая статистически достоверного повышения смертности мальков гуппи.
9.4. Исследования изменений показателей водной среды
Санитарно-экологические последствия присутствия в воде исследуемого
вещества оцениваются по его влиянию на БПК воды.
5
Исследования проводятся при 20 °C в стеклянных сосудах объемом 5 дм3, заполняемых природной морской водой, профильтрованной через мельничный газ N 76 и насыщенной кислородом.
В сосуды вносится исследуемое вещество в 5 - 7 концентрациях, различающихся на порядок. Один из сосудов остается чистым и используется в качестве контроля. В исходные сутки, а также через 5 суток в пикнометры отбираются пробы воды (по 2 пикнометра на каждую пробу), которые выдерживаются в термостате при 20 °C в течение 5 суток.
Через 5 суток после экспозиции в каждом из пикнометров в воде определяют содержание кислорода по Винклеру или с применением специально приспособленных оксиметров.
Расчет величины БПК производится следующим образом:
5
БПК = [O ] - [O ] ,
5 2 исх 2 t
где: [O ] - исходная концентрация кислорода в воде,
2 исх
[O ] - концентрация кислорода в пробах на соответствующий срок
2 t
наблюдения.
Результаты используются для составления таблицы или графиков
зависимости БПК от времени и концентрации исследуемого вещества.
5
Анализ результатов исследования проводится по оценке действия вещества
на величину БПК в опыте и в контроле:
5
БПК (оп) - БПК (контр)
5 5
N = ---------------------- x 100%,
БПК (контр)
5
где: БПК (оп) и БПК (контр), соответственно, в опыте и в контроле на
5 5
один и тот же срок.
Безвредной для процесса самоочищения следует считать такую
концентрацию, при которой показатель БПК отклоняется от соответствующих
5
значений в контроле не более чем на 20% (т.е. N < 20%).
Для вычисления концентрации, вызывающей 20% отклонение, путем интерполяции может быть использовано следующее уравнение:
20 - N
1
C = C + ------- x (C - C ),
1 N - N 2 1
2 1
где: C - концентрация вещества, вызывающая отклонение значений БПК от
5
аналогичных значений в контроле на 20%; C и C - концентрации вещества,
1 2
вызвавшие отклонения БПК менее и более чем на 20% соответственно; N и N
5 1 2
- величины этих отклонений.
9.5. Определение величины временного норматива.
Из концентраций, выведенных в процессе исследований в качестве максимальных допустимых для каждого из объектов исследования, выбирается наименьшая, которая рассматривается в качестве временного расчетного норматива - ориентировочного безопасного уровня воздействия (ОБУВ) вещества.