6.1. Мидии
6.1.1. Характеристика тест-объекта
Мидия - широко распространенный вид двустворчатых моллюсков, образует две экологические морфы: скаловую и иловую. Скаловая мидия обитает в прибрежной зоне на каменистых субстратах в горизонте от сублиторали до глубин 20 - 25 м, образуя в верхнем 10-метровом слое сплошные поселения. Иловая морфа образует банки в открытом море на глубинах 35 - 75 м.
По показателю выживаемости мидия обладает высокой токсикорезистентностью ко многим типам загрязнения. Наряду с этим, пороговая чувствительность по некоторым показателям физиологической активности этого моллюска находится на уровне ПДК вещества для водных объектов рыбохозяйственного значения. Широкая распространенность и низкая смертность при изменении абиотических факторов позволяют легко добывать экспериментальный материал и содержать мидий в лабораторных условиях. В то же время повышенная чувствительность физиологических функций к действию токсикантов позволяет с большой точностью определять пригодность водной среды для жизнедеятельности моллюсков.
Для регистрации показателей токсичности используют следующие тест-функции: интенсивность потребления кислорода, биссусный тест, трофическая активность, степень агрегированности и скорость собирания в друзы.
Для проведения исследований наиболее пригодны молодые неполовозрелые мидии размером не более 30 мм, находящиеся в фазе активного роста. На этой стадии онтогенеза мидии обладают наибольшей двигательной, дыхательной и трофической активностью и меньше подвержены индивидуальным различиям, связанным с развитием гаметогенетического цикла.
Мидии легко культивируются в лабораторных условиях, что позволяет всегда иметь в лаборатории необходимое количество экспериментального материала, однако в лабораторных условиях не всегда удается создать наиболее оптимальные условия для обитания моллюсков. В связи с этим данный биотест ориентирован на применение в условиях морских лабораторий и полевых экспедиций, использующих живой материал непосредственно из моря.
На Черном море мидия размножается практически круглый год с ярко выраженными пиками в феврале - марте, апреле - мае и августе - сентябре. В планктоне личинки находятся от 8 до 14 суток в зависимости от температуры воды, затем оседают на различные субстраты. Молодь мидий размером 20 - 30 мм можно найти в водоеме практически круглый год.
6.1.2. Условия лабораторного содержания
При исследовании на мидиях используют следующее оборудование: респирометры;
термооксиметры модели UT-800, либо анализаторы параметров водной среды марки HORIBA, модель U-7;
счетная камера Нажотта;
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
прибор для определения оптической плотности воды.
6.1.3. Отбор мидий для опыта
Друзы моллюсков, доставленные из моря, разбирают на отдельные особи, отделяют от обрастаний и детрита и тщательно промывают чистой морской водой. Отделять мидии друг от друга следует осторожно, во избежание повреждения биссусных желез и травмирования моллюсков. Срезают мидий с друзы маленькими ножницами, обрезая биссусные нити у основания раковины. Для отбора мидий в эксперимент и первичной оценки физиологического состояния анализируемой популяции, очищенных мидий помещают в аквариум с проточной водой на 15 - 25 минут и наблюдают за их двигательной активностью. Здоровые мидии размером 15 - 25 мм начинают шевелиться и пытаются перемещаться по дну аквариума с помощью ноги уже через 2 - 3 минуты после помещения в воду. По количеству двигающихся особей можно предварительно судить о состоянии популяции. В норме примерно 95% всех отобранных мидий проявляют двигательную активность в первые 5 минут.
6.1.4. Проведение исследований
При постановке опыта у каждой группы испытуемых моллюсков одновременно регистрируется несколько параметров физиологической активности. Для этого в качестве рабочей камеры рекомендуется использовать герметичные респирометры объемом 2 - 3 дм3 с большой площадью дна, на который размещаются датчики постоянной регистрации содержания кислорода, магнитная мешалка, пробоотборник проб воды для определения концентрации корма при выяснении трофической активности тест-объектов. В полевых условиях магнитная мешалка может быть заменена на электромотор (питаемый от аккумулятора или батареи и снабженный крыльчаткой), помещенный в воду. Если по схеме эксперимента дыхательная активность не измеряется, то перемешивание воды может осуществляться с помощью барбатации.
Число организмов в эксперименте 50 - 100 экземпляров. Количество параллельных серий 2 - 3.
Для определения влияния того или иного токсиканта на физиологическую активность мидий в респирометры наливают морскую воду, содержащую определенное количество испытуемого вещества. Выбор рабочих концентраций осуществляется по стандартной схеме токсикологического биотестирования, включая предварительный и окончательный этап эксперимента. Если необходимо провести оценку физиологического состояния мидий, взятых из определенного района побережья, то респирометры заливают природной морской водой, взятой из того же места, что и испытуемые мидии. Как в первом, так и во втором случае, воду перед заливкой в респирометры аэрируют не менее 30 мин. для полного насыщения кислородом. После заливки респирометров водой и их герметизации, включают магнитную мешалку. Измерения производят через 15 минут. Регистрируются следующие параметры:
а) концентрация кислорода в воде;
б) температура воды;
в) количество мидий, собравшихся в друзы (друзой считается группа соприкасающихся мидий, состоящая из трех или более экземпляров);
г) прикрепленность ко дну аквариума (определяют длинным проволочным щупом, пропускаемым через отверстие в крышке респирометра, которое после определения закрывают пробкой).
Длительность эксперимента определяется скоростью потребления кислорода. Опыт прекращается, когда концентрация кислорода в воде снижается по сравнению с исходной на 30%. Если дыхание происходит очень слабо, то длительность эксперимента следует ограничить до 4 - 5 часов, так как дальнейшая экспозиция может быть сильно замаскирована разложением детрита, выделяемого мидиями.
Для проведения экспериментов, в схему которых включено измерение трофической активности мидий, предварительно готовят кормовую смесь. Обычно это суспензия микроводорослей различных видов, либо гомогенат талломов макрофитов. Опыты по определению трофической активности мидий ведутся без измерения потребления кислорода. Аэратор, работающий на малом режиме, остается в аквариуме на все время эксперимента, так как снижение концентрации кислорода в воде блокирует трофику мидий.
Определенное количество микроводорослей либо определенную навеску гомогената помещают в рабочий аквариум с равномерно размещенными мидиями и тщательно перемешивают с помощью аэратора.
Аликвоты для измерения концентрации пищи в среде отбирают через каждые 5 мин. Все остальные параметры снимают через каждые 15 мин. Аликвоты либо фиксируют для дальнейшего просчета клеток под микроскопом (в случае кормления водорослями), либо помещают в счетную камеру прибора для измерения оптической плотности (в случае кормления гомогенатом). Исходная концентрация корма зависит от разрешающей способности применяемой аппаратуры.
6.1.5. Учет и анализ результатов
На основании экспериментальных данных по стандартным статистическим и биометрическим методикам обрабатывают полученные показатели физиологического состояния мидий. Определяют:
а) интенсивность дыхания - потребление кислорода в единицу времени на единицу биомассы и на одну особь; 2) степень агрегированности - отношение числа особей в друзах к общему числу особей в опыте выражают в процентах;
б) скорость прикрепления к субстрату - время, за которое 50% особей прикрепились ко дну рабочего аквариума;
в) трофическую активность - количество корма, потребленного одной особью за единицу времени.
Сравнивая показатели, полученные у мидий, взятых в качестве контроля, с показателями, полученными у мидий, подвергшихся действию химического вещества, можно оценить степень нарушения физиологического состояния мидий и сделать заключение о токсичности растворов вещества.
6.2. Литорина
Литорин собирают на литорали. Моллюсков одного размера помещают в стеклянные аквариумы емкостью 5 дм3 по 20 - 25 штук в каждый. Смену растворов в опытных аквариумах проводят не реже двух раз в неделю. Температура воды в опыте для северных регионов составляет 4,5 - 12,0 °C, соленость 34,5 - 35 промилле. Кормом для моллюсков служат фукусы.
Взрослых моллюсков и их отложенные кладки инкубируют в соответствующих концентрациях растворов вещества при температуре 11 °C. После вылупления первых моллюсков (науплиальные планктонные стадии) через 60 суток фиксированные кладки анализируют. Критерием токсичности концентраций вещества служило отклонение в эмбриональном развитии моллюсков (смертность, процент вылупления), выживаемость и интенсивность дыхания взрослых литорин.
Для определения интенсивности дыхания (потребление кислорода) используют непроточные респирометры объемом 0,5 дм3, в которые помещают по одному помеченному организму. Интенсивность дыхания определяют по Винклеру.
6.3. Бентосные ракообразные - амфиподы (Gammarus finmarchicus, Niphargoides maeoticus) и др.
Амфипод (бокоплавов) собирают в прибрежной зоне на литорали и акклиматизируют к лабораторным условиям 7 суток при температуре, близкой к среде их обитания.
Влияние различных концентраций химических веществ на амфипод исследуют в условиях острого и хронического экспериментов при оптимальных температурных условиях (соответствующих температурному режиму морей северных и южных регионов страны). Длительность экспериментов составляет 4 и 30 суток, соответственно. Опыты ставят не менее чем в трех повторностях. Подопытных рачков содержат в аквариумах объемом от 0,3 до 2,0 дм3 или кристаллизационных чашках. В качестве корма используют бурые водоросли (фукус) и кусочки рыбы. О токсичности различных концентраций вещества судят по выживаемости взрослых особей и молоди, поведенческим реакциям и по нарушению рефлекса питания. В последнем случае применяют сообщающиеся двухкамерные аквариумы, заполненные раствором исследуемого вещества. В эксперименте используют голодных амфипод, взятых из чистой морской воды (контроль), а также после предварительного 5-суточного экспонирования их в различных концентрациях вещества. Амфипод сажают в один отсек, в другой отсек помещают пищевой раздражитель. Затем регистрируют двигательную активность рачков в течение 10 минут, определяя предпочтение пребывания в каждой из двух зон, направление движений, время нахождения корма.
6.4. Морские ежи
Исследуется выживаемость взрослых морских ежей, а также морских ежей на ранних этапах онтогенеза, являющихся компонентом планктонного сообщества (меропланктон).
Эксперименты по выживаемости взрослых ежей проводятся аналогично вышеописанным экспериментам (п. 6.3 Приложения 3) с бентосными ракообразными и моллюсками.
Ниже приводятся приемы исследования на ранних этапах развития (эмбрионы и личинки) морских ежей.
6.4.1. Характеристика тест-объекта
В 70 - 90-е годы исследователями разных стран разработана методология биотестирования с использованием гамет, зародышей и личинок морских ежей - "Sea Urchin Test System". Наиболее широкое применение получил метод, основанный на анализе эмбрионального и раннего личиночного развития морских ежей, - "Sea Urchin Embryo Test" (Kobayashi N., 1984. Marine ecotoxicological testing with Echinoderms // Personne G., Jaspers E., Clans C. (eds.) Ecotoxicological Testing for the Marine Environment. Belgium, Breden: State Univ. Ghent & fast Mar. Sci. Res. V. 1, p. 341 - 405). Его основные преимущества: возможность получения большого количества гамет и синхронно развивающихся зародышей; простота инкубации зародышей и личинок на ранних этапах развития в контролируемых условиях; легкость прижизненных наблюдений и анализа фиксированного материала, поскольку нормальный эмбриогенез морского ежа и отклонения от нормы (аномалии развития) детально описаны; возможность использования разных видов морских ежей, так как чувствительность их половых клеток и зародышей к химическим веществам практически одинакова.
Для получения половых клеток можно использовать морских ежей любого из видов, обитающих в морях России. Это в основном - шаровидные морские ежи стронгилоцентротусы (Strongylocentrotus droebachiensis, S. nudus, S. intermedius), дисковидные морские ежи (Echinaracknius parma, Scaphechinus mirabilis) и ловениды (Echinocardium cordatum).
Морских ежей отлавливают в сезон их размножения, так как только зрелые гонады содержат достаточное количество качественных половых клеток. Для стимуляции нереста применяют инъекцию в превисцеральную полость тела (через перистомальную мембрану) 0,5 см3 0,5 М раствора KCl (на дистиллированной воде). Ежей укладывают аборальной стороной вниз на плоскую поверхность. После начала выделения половых клеток (яйцеклетки имеют желто-оранжевый цвет, сперма - белый) самцов сразу отделяют от самок. Самку следует быстро обмыть сначала пресной водой (чтобы уничтожить случайно попавшие сперматозоиды), затем морской и поместить на высокий узкий стакан объемом 100 - 200 мл, заполненный фильтрованной морской водой таким образом, чтобы аборальный полюс ежей был погружен в воду. Сразу после этого из гонопоров начинают вытекать струйками зрелые яйца, довольно быстро оседающие на дно стаканов. Основная масса яиц вытекает в воду за 15 - 30 минут. Воду из стаканов сливают, заменяют свежей и дают яйцам снова осесть; эту процедуру повторяют 2 - 3 раза. Рекомендуется также профильтровать суспензию яйцеклеток через мельничный газ (размер ячеи 100 x 100 мкм) для освобождения клеток от студенистой оболочки и очистки суспензии от механических примесей. Полученные отмытые яйца желательно сразу же использовать для опыта. В случае необходимости их можно хранить в холодильнике без перемешивания в течение нескольких часов. Партия яйцеклеток не должна содержать недозрелых (ооциты, определяемые по наличию крупного пузырькового ядра) или перезрелых (разрушающихся) клеток.
Сперму следует извлекать из семенников вскрытых самцов и хранить в "сухом" виде в холодильнике или на льду в течение 6 - 12 часов. Перед использованием ее следует разбавить морской водой и таким образом активировать.
6.4.2. Проведение исследований
Предварительно необходимо проверить способность гамет к оплодотворению. Каплю суспензии яйцеклеток помещают на предметное стекло и вносят разбавленную морской водой сперму. Половые клетки считаются качественными, если в течение 3 мин. после осеменения оболочка оплодотворения (отслаивающаяся в результате кортикальной реакции желточная оболочка яйцеклетки) появляется не менее чем у 95% яйцеклеток.
Посуда должна быть стеклянная или нетоксичная пластиковая, однократного использования. Стеклянную посуду следует мыть питьевой содой, без применения мыла и детергентов. Объем инкубационной среды зависит от задач эксперимента, может составлять от 0,3 мл до единиц, десятков и сотен миллилитров.
Яйцеклетки должны быть распределены по дну инкубационной емкости монослоем. Оптимальная концентрация яйцеклеток в среде при проведении экспериментов в течение 48 - 96 часов (время, достаточное до достижения стадии плутеуса у большинства видов морских ежей) не должна превышать 300 кл/см3. Концентрацию яйцеклеток в среде подсчитывают в 3 - 5 аликвотах по 0,01 см3, взятых из взвешенной суспензии яиц, определяют среднее значение и рассчитывают концентрацию в 1 см3.
В пределах одного эксперимента следует использовать один образец спермы с наиболее подвижными и жизнестойкими сперматозоидами. Необходимо соблюдать определенный порядок внесения гамет в инкубационную среду. Рекомендуется первоначально вносить в инкубационную среду яйцеклетки, а затем - сперматозоиды. В этом случае нет необходимости определять концентрацию сперматозоидов, достаточно лишь соблюдать рекомендации по конечному разведению спермы для того, чтобы избежать полиспермии. Величины конечного разведения спермы в инкубационной среде - от 1:60000 до 1:100000.
Для того чтобы правильно идентифицировать стадии развития зародышей и личинок, определять время их прохождения и отличать нормальных зародышей и личинок от аномалий развития, предварительно следует составить таблицу нормального развития используемого в работе вида морского ежа.
Для различных видов стронгилоцентротусов (Strongylocentrotus droebachiensis, S. Nudus и S. Intermedium) можно использовать уже имеющиеся в литературных источниках таблицы. Все опыты должны проводиться при одинаковой температуре, находящейся в пределах оптимального для каждого вида диапазона, и в оптимальных диапазонах солености (обычно 28 - 32 промилле) и pH (обычно 7,8 - 8,2).
На определенных этапах развития (обычно это оплодотворение, первое деление дробления, средняя бластула, поздняя гаструла и плутеус) часть зародышей и личинок (не менее 100 экземпляров на каждой стадии) отбирают из инкубационной среды и фиксируют слабым раствором (конечная концентрация 0,02 - 0,05%) формальдегида или глутаральдегида на морской воде. При использовании иммунологических планшетов фиксацию следует производить прямо в ячейках. Следует иметь в виду, что наличие фиксатора в близлежащих ячейках оказывает отрицательное влияние на личинок, поэтому фиксацию нужно проводить на каком-нибудь одном (конечном) этапе развития (например, гаструлы или плутеуса). На стадиях оплодотворения, первого деления и средней бластулы зародыши, находящиеся в оболочке оплодотворения, неподвижно лежат на дне, что позволяет вести прижизненное наблюдение и осуществлять необходимые подсчеты с использованием инвертированного микроскопа.
Описание этапов развития морского ежа и типичные аномалии эмбрионального развития приведены в таблицах 6.4.1.а, 6.4.1.б.
6.4.3. Учет и анализ результатов
Для получения достоверных результатов опыты с каждым тестируемым
образцом вещества в определенной концентрации следует проводить не менее
чем в двух повторностях и не менее чем в двух параллелях в пределах каждой
повторности. Подсчитывают долю (в процентах) нормальных и аномальных
зародышей и личинок из расчета на 100 экземпляров на каждом этапе развития.
Определяют среднее значение, его ошибку (или стандартное отклонение).
Определяют достоверность различий между контрольными и экспериментальными
данными по критерию Стьюдента. Для определения полулетальной концентрации
токсиканта (ЛК ) можно использовать пробит-анализ.
50
Таблица 6.4.1.а
Описание этапов индивидуального развития
Strongylocentrotus intermedius
|
Этап
|
Основные признаки этапа развития
|
Время наступления осеменения при t
20 °C
|
|
Оплодотворение
|
Оплодотворенное яйцо; сформированная оболочка оплодотворения
|
30 секунд
|
|
Первое деление дробления
|
Дробление полное, радиальное, равномерное
|
1 час 07 минут
|
|
Средняя бластула (до вылупления)
|
Зародыши подвижны и сохраняют сферическую форму; толщина стенок бластоцеля везде одинакова (диаметр бластоцеля около 0,8 мкм)
|
9 часов 30 минут
|
|
Поздняя гаструла (плавающая личинка)
|
Завершение формирования первичной кишки, возникновение орального контакта и связанное с этим появление первых признаков двусторонней симметрии
|
20 часов 25 минут
|
|
Плутеус
|
Сформировалась первая и вторая пары рук. Отделы пищеварительного тракта морфологически полностью выражены
|
30 часов
|
Таблица 6.4.1.б
Типичные аномалии эмбрионального развития морских ежей
┌──────────────┬──────────────────────────────────────────────────────────┐ │ Этап развития│ Аномалии развития │ ├──────────────┼──────────────────────────────────────────────────────────┤ │Образование │Несколько полюсов отхождения; деформация перивителлинового│ │оболочки │пространства │ │оплодотворения│ │ ├──────────────┼──────────────────────────────────────────────────────────┤ │Первое деление│Полиспермия, которая проявляется в многополюсных митозах, │ │дробления │аномальном преждевременном дроблении, неправильной │ │ │ориентации бластомеров │ ├──────────────┼──────────────────────────────────────────────────────────┤ │Бластула │Остановка развития, зародыши во многих случаях долго │ │ │сохраняют оболочки оплодотворения; │ │ │Дезагрегация бластомеров вскоре после вылупления │ ├──────────────┼──────────────────────────────────────────────────────────┤ │Гаструла │Торможение образования первичной кишки; │ │ │Первичная кишка неправильной формы; │ │ │Мезенхимная бластула (клетки первичной мезенхимы заполняют│ │ │бластоцель); │ │ │Экстрогаструляция (выпячивание кишки наружу) │ ├──────────────┼──────────────────────────────────────────────────────────┤ │Плутеус │Нарушение формирования личиночного скелета; уменьшение │ │ │размеров по сравнению с нормальными; изменение пропорций │ │ │тела; деформация кишечника │ └──────────────┴──────────────────────────────────────────────────────────┘