Приложение 11. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И УЧЕТА ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА И ОСНОВНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП БАКТЕРИЙ В ДРОЖЖАХ И СЫРЬЕ
МЕТОДЫ
ВЫЯВЛЕНИЯ И УЧЕТА ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА И ОСНОВНЫХ
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП БАКТЕРИЙ В ДРОЖЖАХ И СЫРЬЕ
Степень зараженности дрожжей и сырья определяется разработанным Ленинградским отделением ВНИИХП методом посева их на селективные агаризованные среды с нистатином. Нистатин представляет собой антибиотик, обладающий сильным противогрибковым действием. Он задерживает рост дрожжей и плесневых грибов, но не влияет на бактерии. Концентрация нистатина, полностью задерживающая рост дрожжей, равна 20 ед. антибиотика на 1 мл среды. При активности нистатина 2500 ед./мг растворяют 12 мг водорастворимого либо 120 мг спирторастворимого нистатина в 100 мл стерильной воды. Растворы нистатина могут храниться в темном холодном месте не более 2 - 3 сут.
Применение сред различного состава с добавлением нистатина позволяет раздельно учесть количество бактерий некоторых физиологических групп, наиболее часто встречающихся в дрожжевом производстве - лактобацилл, лейконостока, гнилостных бактерий, бактерий кишечной группы. Посторонние дрожжи выявляют на синтетической среде, содержащей в качестве единственного источника азота лизин.
Для выявления и учета указанных микроорганизмов применяются следующие среды:
Микроорганизмы Питательная среда
Молочнокислые бактерии Сусло-агар с мелом
(лактобациллы и лейконосток) и нистатином
Лейконосток Дрожжевой агар с сахарозой
и нистатином
Гнилостные бактерии Молочный агар с нистатином
Кишечная палочка Синтетическая среда с
индикатором (розолово-
дифференциальный агар
в модификации
Олькеницкого И.С.)
Дрожжи
общее количество Сусло-агар
посторонние Синтетическая среда
с лизином
Перед посевом пробы исследуемого материала разводят стерильной 0,1-процентной пептонной (или водопроводной) водой. 1 г мелассы разводят обычно в 10 и 100 раз.
Так как степень обсемененности дрожжей микроорганизмами разных групп неодинакова, для каждой группы подбирают определенное разведение с тем, чтобы на чашке Петри выросло 20 - 100 колоний:
┌─────────────────────────┬───────────────────────────────────────────────────┐ │Выявляемые микроорганизмы│ Разведение 1 г дрожжей │ │ ├─────────────────────────┬─────────────────────────┤ │ │ ЧК и ЕЧК │ товарных │ ├─────────────────────────┼─────────────────────────┼─────────────────────────┤ │Молочнокислые бактерии │100 тыс., 1 млн., 10 млн.│100 тыс., 1 млн., 10 млн.│ │Лейконосток │1 тыс., 10 тыс., 100 тыс.│10 тыс., 100 тыс. │ │Гнилостные бактерии │100, 1 тыс., 10 тыс. │1 тыс., 10 тыс., 100 тыс.│ │Кишечная палочка │100, 1 тыс. │100, 1 тыс. │ │Дрожжи │ │ │ │ общее количество │10 млн., 100 млн. │10 млн., 100 млн. │ │ посторонние │100, 1 тыс., 10 тыс. │1 млн., 10 млн., 100 млн.│ └─────────────────────────┴─────────────────────────┴─────────────────────────┘
В стерильном стаканчике взвешивают 1 г дрожжей из середины бруска (или 1 мл бродящей жидкости). В стаканчик наливают немного стерильной воды из колбы, в которой ее содержится 100 мл. Дрожжи размешивают стерильной палочкой, суспензию переводят в ту же колбу с водой и получают разведение дрожжей 1:100. Потом суспензию последовательно разводят в стерильной воде, увеличивая разведение с каждым последующим разведением в 10 раз. При каждом пересеве нужно пользоваться новой стерильной пипеткой.
В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл исследуемой пробы соответствующего разведения, затем в чашки, предназначенные для выявления бактерий, вносят по 1 мл раствора или суспензии нистатина, стерильный мел на кончике скальпеля (при выявлении молочнокислых бактерий), вливают расплавленную и охлажденную до 40 - 55 °С питательную среду.
Выращивание ведут в термостате при 30 °С. Через 24 ч подсчитывают колонии лейконостока на дрожжевом агаре. Гнилостные бактерии в зависимости от активности их протеолитических ферментов образуют зоны просветления среды через 48 - 72 ч, молочнокислые - через 72 ч. Колонии посторонних дрожжей подсчитывают через 5 сут.
Количество выросших колоний умножают на соответствующее разведение.
Количество бактерий выражают числом клеток в 1 г прессованных дрожжей или в 1 мл культуральной жидкости, а содержание посторонних дрожжей - в процентах от общего количества дрожжевых клеток в посеве.
Мелассу считают хорошей, если в 1 г ее содержится до 2 тыс. микроорганизмов без преобладания отдельных видов. В посредственной мелассе (2 - 10 тыс. клеток) преобладают отдельные виды. В плохой меласса количество микроорганизмов превышает 10 тыс. клеток в 1 г и также преобладают отдельные виды.
При удовлетворительной работе завода в 1 г дрожжей допускается следующее содержание микроорганизмов:
┌────────────────────────────┬───────────────────────────────────┐ │ Микроорганизмы │ Дрожжи │ │ ├───────────┬───────────┬───────────┤ │ │ ЧК │ ЕЧК │ товарные │ ├────────────────────────────┼───────────┼───────────┼───────────┤ │Молочнокислые, млн. │До 1 │До 10 │До 100 │ │Лейконосток │0 │0 │До 1 млн. │ │Кишечная палочка │0 │0 │0 │ │Гнилостные бактерии │До 500 │До 1000 │До 5000 │ │Посторонние дрожжи, % │0 │0,001 │До 10 │ └────────────────────────────┴───────────┴───────────┴───────────┘
Если содержание посторонних микроорганизмов превышает допустимые нормы, следует установить причины нарушений и принять меры к их устранению.