5.1. Артемия салина
5.1.1. Характеристика тест-объекта
Жаброногий рачок - артемия салина (Artemia salina L.) удобен в качестве тест-объекта, что определяется его эвригалинностью, доступностью в любое время года исходного материала (яиц), возможностью длительного хранения яиц (в течение нескольких лет), легкостью содержания и культивирования в воде разной солености. Адаптация при этом не требуется.
При благоприятных условиях выклев науплиев артемий из яиц происходит за 1 - 2 суток (при 25 °C - в течение 24 часов; при 20 °C в течение 48 ч). В течение первых дней жизни науплии не потребляют оформленной пищи, находятся на эндогенном питании. На 4-е сутки науплии переходят на активное питание оформленной пищей. В зависимости от температурных условий артемии достигают половозрелого состояния в течение 3 - 4 недель после вылупления из яиц.
В связи с различной устойчивостью артемий к токсикантам на разных стадиях развития, в токсикологических экспериментах ставят опыты с развивающимися яйцами, науплиальными стадиями артемий и взрослыми особями, используя каждую стадию как отдельный тест-объект.
Из всех стадий развития артемий наиболее чувствительным тест-объектом являются науплии в возрасте 1 суток (переход ортонауплиуса в метанауплис). Данная стадия используется как тест-объект в экспериментах при разработке ПДК вещества.
5.1.2. Условия лабораторного содержания
Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:
микрокомпрессоры;
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
оксиметр;
pH-метр;
прибор для определения солености воды;
мембранные фильтры (размер пор 0,45 мкм и 3 - 5 мкм);
дистиллированная вода;
стеклянные бутыли на 20 л - 2 штуки;
стаканы лабораторные на 50, 100, 300, 500, 1000 см3;
чашки Петри;
градуированные пипетки на 10, 5, 1, 0,1 мл;
пипетки Пастера стеклянные, вместимостью 2 см3 с укороченным и оплавленным концом для пересадки рачков;
реактивы марки "хч", а также морская соль;
двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия
2 2 7
двухромокислого;
сухие яйца Artemia salina L. (хранятся в холодильной камере).
Исследование с артемиями (Artemia salina L.) проводят при искусственном или естественном освещении, температуре 20 +/- 2 °C, от выклева из яйца (односуточные науплии) до половозрелого состояния (21 сутки) на природной морской воде или на искусственной морской воде определенной солености.
При проведении экспериментов с артемиями на искусственной морской воде, последняя служит контролем в экспериментах.
В связи с эндогенным питанием науплиусы артемий не нуждаются в подкормке в течение четырех суток после выклева. В дальнейшем в качестве корма для них используют культуры одноклеточных перидиниевых водорослей из родов Phaeodactylum и Exuviella, или желто-зеленых жгутиковых водорослей Nephrochloris salina, выращиваемых на среде Гольдберга.
Плотность клеток водорослей в среде с рачками при их кормлении - 100 тыс. кл/см3 (слегка зеленоватый или бежевый цвет среды). Подкармливают рачков через 2 суток.
При достаточном внесении корма рачки распределяются равномерно по всей толще воды и активно движутся. При недостатке корма артемии задерживаются у стенок и дна аквариума, взмучивая осадок, при излишке корма собираются у поверхности воды, при этом движение становится замедленным.
В опыт необходимо брать яйца артемий с высоким процентом выклева (60 - 100%).
Чтобы получить исходный материал для исследования, 1 - 3 г сухих яиц помещают в химический стакан объемом 500 мл и заливают водопроводной водой, заранее отстоянной и аэрируемой в течение суток. Через 30 мин., не взбалтывая содержимого стакана, сливают слой воды над осевшими яйцами, удаляя таким образом пустые оболочки яиц и погибшие яйца. Процедуру очистки повторяют несколько раз.
Отмытые яйца вновь заливают пресной водой, подводят аэрацию и выдерживают в таком состоянии в течение суток. Через сутки пресную воду сливают и яйца несколько раз промывают фильтрованной и проаэрированной морской водой нужной солености с pH 7,8 - 8,2.
Промытые яйца для выклева помещают в плоский кристаллизатор, наполненный морской водой нужной солености. Содержимое кристаллизатора взбалтывают, при этом яйца располагаются по дну монослоем. Через 18 - 24 часа в кристаллизаторе вылупляются первые личинки. Для дружного выклева необходима аэрация и освещенность не менее 1500 - 2500 лк/м2.
Для получения синхронизированного материала первых выклюнувшихся науплиусов Artemia salina L. тщательно отбирают пипеткой Пастера и переносят в стакан (объемом 150 см3) с морской водой. Через час в кристаллизаторе накапливаются новые науплиусы. Отбирают и переносят науплиусов в тот же стакан с морской водой по мере их выклева - 2 - 3 раза в течение трех часов, концентрируя организмы возле одной из стенок направленным источником света (новорожденные науплиусы имеют положительный фототаксис). Далее односуточные науплиусы Artemia salina L. используют в эксперименте.
Один раз в месяц (или при использовании новой партии яиц) проводят
проверку выклюнувшихся науплиусов на пригодность к токсикологическому
анализу, то есть проверяют их физиологическую чувствительность. Для этого
определяют значение LC (72 ч) эталонного химического вещества
50
двухромовокислого калия для науплиусов.
Если значение LC для организмов находится в диапазоне 6,5 - 8,0
50
мг/дм3 эталонного вещества, науплиусы пригодны для проведения эксперимента.
В случае непопадания LC в указанный диапазон концентраций, проверяют
50
соблюдение процедуры выполнения определений, условия подготовки организмов
к токсикологическому анализу и, при необходимости, используют новую партию
яиц.
5.1.3. Проведение исследований
Исследования на артемиях проводят в 2 этапа (предварительный и основной).
В предварительном кратковременном исследовании (оценка острого токсического действия вещества в течение 96 часов) по 20 экземпляров науплиусов рассаживают по чашкам Петри в контрольную и опытную среды (40 мл). Число повторностей равно трем. Показания снимают ежедневно (в 1, 2, 3 и 4 сутки), удаляя погибших рачков.
Исследуют, как правило, 5 концентраций вещества. При этом следует стремиться к тому, чтобы по крайней мере две из концентраций вызывали бы эффект менее и более 50%.
При длительном исследовании (оценка хронического токсического действия вещества в течение 21 суток) эксперименты проводят в стаканах емкостью 300 - 500 см3, число повторностей равно трем. Плотность посадки из расчета 1 экземпляр на 25 см3 среды (количество рачков в контрольных и опытных емкостях каждой концентрации - по 10 экземпляров).
После 4-х суток эксперимента, науплиусов кормят водорослями каждые двое суток. Показания снимают по возможности ежедневно (удаляя погибших рачков). Через 21 сутки исследование заканчивается.
5.1.4. Учет и анализ результатов
Для определения наличия токсического действия растворов вещества на артемий, рассчитывают снижение (в процентах) выживаемости тест-организмов в опыте по сравнению с контролем. Используют статистическую обработку результатов эксперимента (Приложение 4 данных Методических указаний).