1. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для одноклеточных водорослей
1.1. Введение
Оценка влияния веществ на одноклеточные водоросли осуществляется по нижеследующим показателям:
а) изменение численности клеток водорослей при воздействии веществ, содержащихся в тестируемой воде, по сравнению с контролем;
б) характер изменения численности клеток: их увеличение или снижение, отражающее интенсивность деления клеток водорослей по отношению к контролю.
Критерием токсичности раствора вещества является достоверное снижение численности клеток водорослей ("выживаемость") в растворе по сравнению с контролем.
Критерием эвтрофирующего эффекта вещества является достоверное увеличение численности клеток водорослей в различных концентрациях вещества. Лимитирующий показатель вредности вещества в данном случае - экологический. Наряду с изучением динамики численности водорослей, к регистрируемым показателям в опыте следует относить изменение pH; визуальные наблюдения за состоянием культуры водорослей: изменения в окраске, форме клеток и состоянии суспензии (взвешенное, опускание на дно, всплывание к поверхности, гомогенность или агрегация) по сравнению с контролем.
В качестве экспресс-метода оценки токсичности вещества можно использовать приборный метод быстрой или замедленной флуоресценции водорослей (Минрыбхоз СССР введены в действие методические разработки ВНИРО от 18 декабря 1987 г. N 291-ц "Методические рекомендации по экспрессному биотестированию природных и сточных вод с использованием замедленной флуоресценции одноклеточных водорослей". М.: ВНИРО, 1987). Показания изменения флуоресценции водорослей в растворах вещества по отношению к контролю следует относить к основным показателям, характеризующим процессы жизнедеятельности одноклеточных водорослей. Показания быстрой и замедленной флуоресценции относятся только к живым клеткам, отражают интенсивность процесса фотосинтеза водорослей, по калибровочной кривой позволяют определить количество живых клеток в эксперименте.
Кратковременная оценка токсичности раствора вещества - до 24 - 96 ч - позволяет определить наличие острого токсического действия вещества на одноклеточные водоросли, а длительное исследование - до 14 - 21 суток - его хроническое токсическое действие.
К дополнительным показателям при исследовании следует относить: оценку биомассы водорослей (полученную расчетным методом), оценку скорости и темпа деления клеток (расчет генераций), содержание фотосинтезирующих пигментов (хлорофилла и каротиноидов), соотношение живых и мертвых клеток водорослей (используя люминисцентный микроскоп или различные витальные красители - цитохимический метод).
1.2. Характеристика тест-объектов
В качестве основного стандартного тест-объекта рекомендуется использовать лабораторную монокультуру одноклеточных золотистых водорослей феодактилум трикорнутум (Phaeodactylum tricornutum). Вид представлен клетками овально-треугольной формы с шипиками на концах. Клетки неподвижны, длина 13 - 16 мкм. Размножение вегетативное, путем простого деления клеток надвое. Численность клеток увеличивается за трое суток не менее чем в 3 раза. После пересева культуры на новую среду, экспоненциальная фаза роста наступает на 4 сутки. Данный вид водорослей используется в международном стандарте оценки качества воды (ИСО 10253:2006 Качество воды. Тест по угнетению роста морских водорослей Skeletonema costatum и Phaeodactylum tricornutum).
В исключительных случаях или в качестве дополнительной культуры возможно использовать другой вид водорослей из перидиниевых - экзувиелла кордата (Exuviella cordata) или пророцентрум миканс (Prorocentrum micans), с указанием срока выхода культуры в экспоненциальную фазу роста в культуре, темпа деления клеток и диапазона чувствительности водорослей к стандартному (эталонному) веществу бихромату калия (п. 1.4 Приложения 2 настоящих Методических указаний).
1.3. Условия лабораторного содержания одноклеточных водорослей
Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:
климатостат (люминостат) любого типа, оснащенный лампами дневного света 3000 - 6000 лк, обеспечивающий поддержание температуры (20 +/- 2) °C;
прибор для определения солености воды;
pH-метр;
оксиметр любого типа с погрешностью измерения не более 0,5 мг/дм3;
спиртовка;
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
камера счетная Нажотта (или камера Горяева);
предметные и покровные стекла;
фильтровальная установка любого типа;
фильтры мембранные (размер пор 3,5 мкм; 0,45 мкм);
пипетки автоматические-дозаторы на 0,1 - 0,2 см3;
готовая искусственная морская соль;
двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или стандарт-титр калия
2 2 7
двухромовокислого;
стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 100, 500, 1000 см3;
колбы конические на 100, 150, 250, 500, 1000 см3;
культура морских одноклеточных водорослей Phaeodactylum tricrnutum Bohlin.
Выращивают водоросли (Таблица 1.3.1) на среде Гольдберга.
Таблица 1.3.1
Состав питательной среды Гольдберга
┌──────────┬──────────────────┬────────────────────┬──────────────────────┐ │ N │ Реактив │ Навеска реактива │ Количество (см3) │ │исходного │ │ г/100 см3 │ каждого исходного │ │ раствора │ │ дистиллированной │ раствора на 1 дм3 │ │ │ │ воды │морской природной воды│ ├──────────┼──────────────────┼────────────────────┼──────────────────────┤ │ 1 │ KNO │ 10,1 │ 2 │ │ │ 3 │ │ │ ├──────────┼──────────────────┼────────────────────┼──────────────────────┤ │ 2 │ NaH PO │ 1,421 │ 0,5 │ │ │ 2 4 │ │ │ ├──────────┼──────────────────┼────────────────────┼──────────────────────┤ │ 3 │ MnCl 4H O │ 0,01979 │ 1 │ │ │ 2 2 │ │ │ │ │ CoCl 6H O │ 0,02379 │ │ │ │ 2 2 │ │ │ ├──────────┼──────────────────┼────────────────────┼──────────────────────┤ │ 4 │ FeCl 6H O │ 0,02703 │ 1 │ │ │ 3 2 │ │ │ └──────────┴──────────────────┴────────────────────┴──────────────────────┘
Питательную среду для культивирования готовят на искусственной морской воде или на морской природной воде (черноморской, беломорской, балтийской, каспийской и т.д.), которую предварительно отбирают в незагрязненном районе. Морскую воду фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 3,5 мкм). Дважды стерилизуют, нагревая до температуры 75 - 80 °C и охлаждая до комнатной температуры. В подготовленную таким образом морскую воду добавляют растворы N 1, N 2 и N 3 (см. таблицу 1.3.1). Затем среду стерилизуют третий раз, охлаждают и добавляют раствор N 4.
Приготовленную вышеописанным способом среду хранят в темном месте при комнатной температуре. Исходные растворы для приготовления среды хранят в холодильнике, в случае помутнения производят их замену.
Культивируют водоросли в конических колбах объемом 250 - 300 мл закрытых фольгой или ватно-марлевой пробкой в люминостате или климатостате, избегая попадания прямых солнечных лучей. Освещенность 3000 - 6000 люкс. Лампы дневного света размещают на расстоянии 30 - 40 см от поверхности культуры. Соблюдается световой суточный ритм. Температура при культивировании водорослей 20 +/- 2 °C. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1 - 2 раза в сутки.
Водоросли рекомендуется один раз в десять дней пересевать. Для этого в чистую простерилизованную колбу объемом 250 см3 со свежей средой (100 - 150 мл) над пламенем спиртовки приливают примерно 15 - 20 см верхнего росткового слоя из колбы ранее культивируемых водорослей. При этом получают начальную плотность клеток в колбе для культивирования, примерно 300 тыс. кл/см3. Колбу закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, перемешивают, записывают на колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат.
В течение дня содержимое колбы следует перемешивать 1 - 2 раза.
1.4. Проведение исследований
Опыты проводят при оптимальной температуре и освещении, как и культивирование водорослей (п. 1.3 Приложения 3). Используют водоросли в экспоненциальной фазе роста, что соответствует трехсуточной культуре водорослей после пересева. Плотность культуры в колбе в это время достигает примерно 5 млн. кл/мл.
В опыте используют начальную плотность клеток 25 тыс. кл/см. Для этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом, исходя из объема исследуемой концентрации вещества (например, 100 см3) и численности клеток в культуре в экспоненциальной фазе роста (5 млн. кл/см3). В указанном случае в опытную и контрольную среду добавляется по 0,5 см3 трехсуточной культуры водорослей.
Периодически (не реже 1 раза в месяц) необходимо проводить контроль
физиологической чувствительности водорослей. Для этого используют эталонное
химическое вещество - двухромовокислый калий K Cr O марки "хч" или
2 2 7
стандарт-титр калия двухромокислого. Готовят маточный раствор
двухромовокислого калия концентрацией 1 г/м3. Далее методом разбавления
готовят серию растворов с концентрациями 1,0; 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 мг/дм3.
Исследование проводят в течение 96 ч. На основании полученных результатов
рассчитывают среднюю концентрацию K Cr O , вызывающую уменьшение
2 2 7
численности клеток на 50% за 96 ч (ЛК за 96 ч). Если полученное значение
50
ЛК находится в интервале 5,8 - 10,0 мг/дм3, то культура водорослей может
50
быть использована для экспериментов.
Если полученные значения ЛК не попадают в интервал 5,8 - 10,0 мг/дм3,
50
то эксперименты с водорослями не проводят, выясняют причину (условия
культивирования, состав культуральной среды и прочее). Иногда культуру
водорослей заменяют и проводят эксперименты заново.
При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и опытные колбы емкостью 250 см3 наливают по 100 см3 (в колбы емкостью 100 см3 наливают по 50 см3) контрольной среды и исследуемые концентрации вещества. Контролем служит среда Гольдберга. Исследуемые концентрации веществ также готовят на среде Гольдберга.
Затем в опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 см3 (0,25 см3) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста.
Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, их содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную численность клеток, которая должна составлять 25 тыс. кл/мл. Колбы помещают в люминостат (или в климатостат) и экспонируют в течение трех суток (острый) или четырнадцати суток (хронический) эксперимент.
В эксперименте должно быть исследовано не менее 5 концентраций вещества. Повторность трехкратная.
Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа: предварительный и основной (окончательный).
В предварительном остром эксперименте находят интервал токсичных концентраций. Опыты проводят в широком диапазоне концентраций вещества, которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент 10). Например, 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее пяти концентраций в двух повторностях. По результатам эксперимента определяется диапазон концентраций для основного острого и хронического эксперимента.
В основном остром и хроническом эксперименте шаг между концентрациями различается в 2 - 5 раз. Исследуют не менее пяти концентраций в трех повторностях.
Подсчет клеток водорослей проводят в остром опыте ежедневно, в хроническом на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки.
На 14 сутки от начала эксперимента опыт прекращают и устанавливают, оказывают ли исследуемые концентрации вещества хроническое токсическое (или эвтрофирующее) действие на водоросли.
1.5. Учет и анализ результатов
Для подсчета численности клеток под микроскопом используют счетную камеру Нажотта объемом 0,01 см3 (или камеру Горяева).
Подсчет клеток в камере Нажотта осуществляют следующим образом. Камеру Нажотта и покровное стекло толщиной 0,2 - 0,4 мм промывают дистиллированной водой и вытирают насухо. Из каждой контрольной или опытной колбы каплю суспензии водорослей наносят на середину камеры, покровное стекло плотно прижимают к поверхности камеры (в камере не должно быть пузырьков воздуха), дают отстояться 1 - 2 минуты, после чего начинают подсчет в пяти правых верхних и пяти правых нижних вертикальных счетных полосах. Затем выводят среднее количество клеток в одной полосе.
При большом разбросе клеток в полосах просчитывают 10 верхних и 10 нижних полос. Полученное среднее число клеток в одной полосе умножают на коэффициент 1600 и величину разведения (например, при разведении культуры в 10 раз среднее число клеток в одной полосе умножают на 10), определяя численность клеток в 1 см3.
При работе с камерой Горяева суспензию водорослей наносят по капле на
нижнюю и верхнюю сетки счетной камеры. Затем камеру накрывают покровным
стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции. Через
1 - 2 мин. начинают подсчет водорослей в 25 больших квадратах всей камеры.
Рассчитывают численность клеток на 1 см3 среды следующим образом:
4
количество клеток в 25 больших квадратах камеры Горяева умножают на 10 и
получают количество клеток в 1 см3 суспензии.
Из каждой опытной и контрольной колбы просчитывают не менее двух камер.
Подсчет подвижных клеток водорослей (например, эксувиеллы) проводят после фиксации их формалином.
Для этого в мерную пробирку на 10 см3 помещают 1 см3 суспензии водорослей из опытных или контрольных колб. Приливают туда 9 мл питательной среды Гольдберга, перемешивают, добавляют 0,1 см3 4%-го раствора формалина, еще раз перемешивают. Затем из пробирки помещают каплю суспензии водорослей в камеру Нажотта для подсчета клеток.
По окончании эксперимента на водорослях проводят обработку полученных результатов острого и хронического опыта. Рассчитывают среднюю численность клеток водорослей в опыте и контроле (в млн. кл/см3 и в процентах).
Результаты исследования учитываются, если численность клеток водорослей в контроле увеличивается за 96 часов не менее чем в 3 раза.
При изменении численности клеток в контроле менее чем в 3 раза, результаты опыта считаются недействительными.
Достоверность различия между численностью клеток в контроле и опыте устанавливают, используя приемы статистической обработки (Приложение 4 данных Методических указаний).
Достоверность снижения (или увеличения) численности клеток в опыте по сравнению с контролем свидетельствует о наличии острого или хронического токсического (эвтрофирующего) действия исследованных концентраций вещества на водоросли.