7. Оценка генотоксичности вещества
7.1. Вводные замечания
Генотоксичность вещества исследуется на генном, хромосомном или геномном уровне. По этим данным устанавливается его максимальная допустимая концентрация для рыбохозяйственных водных объектов по показателю "генотоксичность".
Для выявления мутаций на генном уровне рекомендуется тест Эймса.
Для выявления хромосомных аберраций в хроническом опыте проводят следующие исследования генетического аппарата на клетках различных тканей рыб:
а) учет частоты хромосомных аберраций и нарушений митотического аппарата деления клеток эпителия хрусталика на стадии анафазы и телофазы;
б) учет частоты хромосомных аберраций на стадии метафазы на жаберном эпителии;
в) учет частоты образования микроядер (микроядерный тест) в эритроцитах.
Оценка генотоксичности вещества по нарушению дифференциальной активности генов может проводиться на политенных хромосомах из слюнных желез хирономид.
В обязательную программу генетических исследований должно входить изучение генных мутаций и хромосомных аберраций одним из методов. Вы их выделили жирным шрифтом. При подозрении, что вещество воздействует на митотическую активность клеток и обладает канцерогенностью, необходимо провести дополнительно исследования по выявлению воздействия вещества на дифференциальную активность генов.
Исследуемые концентрации вещества в эксперименте должны укладываться в диапазон от пороговой концентрации (или ниже) до концентрации выше значения ПДК вещества в 5 раз.
7.2. Учет генных мутаций (тест Эймса)
7.2.1. Характеристика тест-объекта
Наиболее удобными, быстрыми и экономичными способами выявления мутагенной активности являются методы с использованием бактерий. Широкое применение находит тест-система с использованием бактерии сальмонелла тифимуриум (Salmonella typhimurium) (Таблица 7.2.1). Эти методы основаны на аналогичности генетических механизмов повреждения и репарации ДНК у клеток низших и высших организмов.
Таблица 7.2.1
Штаммы S. typhimurium, используемые для выявления
мутагенной активности соединений
┌────────┬─────────────────┬──────────────┬──────────┬────────────────────┐ │ Штаммы │Основная мутация │Дополнительные│ Наличие │ Выявленный тип │ │ │ в опероне │ мутации │ фактора │ мутагенного эффекта│ ├────────┼─────────────────┼──────────────┼──────────┼────────────────────┤ │ТА 1950 │his G 46 │+urvB │- │R-BPS │ │ТА 1535 │his G 46 │rfa urvB │- │R-BPS │ │ТА 100 │his G 46 │rfa urvB │pKM-101 │R-BPS │ ├────────┼─────────────────┼──────────────┼──────────┼────────────────────┤ │ТА 1534 │his D 3052 │+urvB │- │R-FS │ │ТА 1538 │his D 3052 │rfa urvB │- │R-FS │ │ТА 98 │his D 3052 │rfa urvB │pKM-101 │R-FS │ ├────────┼─────────────────┼──────────────┼──────────┼────────────────────┤ │ТА 97 │his D 6610 │rfa urvB │pKM-101 │R-FS │ ├────────┼─────────────────┼──────────────┼──────────┼────────────────────┤ │ТА 102 │his G 428 │rfa+(РАО 1) │pKM-101 │R-BPS │ ├────────┼─────────────────┼──────────────┼──────────┼────────────────────┤ │А 1537 │his C 3076 │rfa urvB │- │RPS │ └────────┴─────────────────┴──────────────┴──────────┴────────────────────┘
Примечание: "+" - обозначение генов дикого типа; rfa - нарушение липополисахаридной капсулы; urvB - нарушение системы эксцизионной реакции; RPS - сдвиг рамки считывания; R-BPS - замена пар оснований.
Сущность использования системы "бактерии-микросомы" заключается в определении способности вещества или его метаболитов индуцировать генные мутации у подопытных штаммов. Если исследуемое вещество (или его метаболиты) обладают мутагенной активностью, то увеличивается количество колоний-ревертантов на чашку Петри в опыте по сравнению с контролем. Под влиянием мутагенных веществ у микроорганизмов-ревертантов происходят обратные мутации, и они приобретают способность жить на среде, лишенной гистидина или другой аминокислоты, по которой отобран тот или другой штамм.
Для выявления промутагенов производят микросомальную активацию, после которой промутагены проявляют мутагенные свойства. Методы приготовления микросомальных ферментов из гепатопан-креаса карпа или других рыб приводятся ниже.
При определении мутагенной активности веществ, нормируемых для воды рыбохозяйственных водных объектов, целесообразно использовать микросомы именно из тканей рыб, а не теплокровных животных, так как экстраполяция результатов, полученных с применением микросом печени теплокровных животных, не всегда оправдана при установлении ПДК веществ вследствие неадекватности протекания метаболических процессов у различных видов животных.
7.2.2. Проведение исследований
7.2.2.1. Оборудование:
бактерицидные облучатели;
центрифуги;
автоклавы;
термостаты;
размельчитель тканей;
водяные термостатирующие бани;
счетчик колоний;
весы;
сушильный шкаф;
дистиллятор.
Реактивы:
K HPO , лимоннокислый натрий, NADP (Rianal);
2 4
KH PO , MgCl , биотин;
2 4 2
KCl, MgSO , L-гистидин;
4
(NH ) SO , БСА, нитрозогуанидин;
4 2 4
Na HPO , глюкозо-6-фосфат, ДМСО.
2 4
Мутагены: Промутагены:
бенз/а/пирен, 2-ацетиламинофлуоредин,
9-аминоакридин, 2-аминофлуорен.
Циклофосфамид;
7.2.2.2. Приготовление минимальной среды (МС). МС готовят следующим
образом. К 300 мл расплавленного агара (компонент 2) добавляют 100 мл
солевого раствора (компонент 1), 10 мл 20%-ного раствора глюкозы и 2,0 мл
раствора MgSO :
4
1. Компонент 1 (солевой раствор):
лимоннокислый натрий - 2,0 г,
K PO x 3H O - 42,0 г,
3 4 2
KH PO - 18,0 г,
2 4
(NH ) SO - 4,0 г,
4 2 4
H O (дист.) - 1,0 дм3.
2
2. Компонент 2 (водный агар):
агар - 20,0 г; H O - 1,0 л.
2
3. 20%-ный раствор глюкозы.
4. 1%-ный раствор MgO x 7H O.
2
5. Агар для верхнего слоя:
NaCl - 6,0 г,
Агар - 7,0 г,
H O - 1,0 дм3.
2
Компоненты 1, 2, 4 и 5 автоклавируют при 0,8 атм. 30 мин. Затем на каждые 80 мл агара добавляют 10 мл L-гистидина (0,5 мм) и биотина (0,25 мМ) в виде стерильных растворов. В качестве полноценной среды (ПС) может использоваться любая среда для энтеробактерий (МПБ и МПА, или АП и АПА). Она стерилизуется в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин. (после стерилизации pH = 7,0).
7.2.2.3. Проверка генетических маркеров. Получают отдельные клоны соответствующих штаммов. Готовят три варианта селективных сред:
а) МС с добавкой L-гистидина;
б) МС с добавкой биотина;
в) МС с добавкой L-гистидина и биотина.
Растворы аминокислоты и биотина вносят в МС из расчета 50 мкг/мл и 1 мкг/мл соответственно. Отбирают по 25 отдельных колоний и пересеивают на селективные среды. Чашки Петри инкубируют при 37 °C двое суток. По характеру роста колоний делают вывод о способности того или иного штамма расти на среде, лишенной гистидина.
7.2.2.4. Хранение индикаторных штаммов. Суспензии штаммов рекомендуется хранить в диметилсульфоксиде (ДМСО) или глицерине при замораживании (-70 °C), а также в слое 0,6% МПА под стерильным вазелиновым маслом. Периодически при пересевах штаммы проверяют на соответствие генотипу.
7.2.2.5. Приготовление фракций. Фракцию микросомных ферментов получают по следующей схеме:
1. Индуцируют синтез микросомальных ферментов в гепатопанкреасе карпа и белого толстолобика ежедневными внутрибрюшинными инъекциями метилхоланна из расчета 80 мг/кг веса в течение трех дней.
2. Извлекают из животных гепатопанкреас, взвешивают, промывают стерильным раствором 0,15 М KCl, измельчают и гомогенизируют в трехкратном объеме 0,15 М KCl. Среда гомогенизации гепатопанкреаса рыб дополнительно содержит 0,6% Na-фосфатный буфер с pH 7,4. Все операции проводят на льду.
3. Гомогенат центрифугируют 15 мин. при 9000 об./мин. и аликвот ("фракция Sg") разливают в пластмассовые емкости объемом 3 - 6 мл.
Фракцию хранят до момента использования не более двух недель (при температуре -80 °C).
7.2.2.6. Приготовление микросомальной активирующей системы. Фракцию Sg размораживают при комнатной температуре и ставят на лед. В эксперименте используют микросомальную активирующую среду, в 1,0 мл которой содержится фракция Sg, 5 мМ глюкозо-6-фосфат, 4 мМ NAPR, 33 мМ KCl, 8 мМ MgCl в 0,1 М K-фосфатном буфере в pH 7,4.
Приготовление исследуемых веществ: Готовят стандартные растворы в дистиллированной воде или в растворе ДМСО (0,1; 1,0; 10,0; 100,0; 1000,0 мкг на чашку Петри).
7.2.2.7. Приготовление бактериальной суспензии. В экспериментах
используют чистую культуру. Для этого культуру штамма с косяка пересевают в
10 мл АП и инкубируют без аэрации 18 ч при 37 °C. Затем 19 мл АПБ необходимо
засеять 1 мл культуры и инкубировать ее при 37 °C на качалке в течение 2 - 3
8
ч до плотности 5 x 10 кл/мл. Культуру центрифугируют 15 мин. при 5000
об./мин. Осадок ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе с таким
9
расчетом, чтобы получить суспензию плотностью 2 x 10 кл/мл.
7.2.3. Проведение исследований
Чашки Петри заливают минимальной средой и выдерживают при комнатной температуре 1 ч. Полужидкий полуобогащенный агар расплавляют и помещают в термостатируемую водяную баню (46 °C) на 20 мин. В каждую пробирку добавляют по 0,1 мл культуры тест-штамма, 0,2 мл раствора исследуемого вещества определенной концентрации и 0,5 мл микросомальной реактивирующей системы. Полученную смесь сразу же перемешивают и выливают на поверхность чашки. Верхний агар должен покрыть поверхность нижнего минимального агара тонким слоем. Вся процедура в целом занимает не более 20 секунд. Затем дают агару застыть и инкубируют при 37 °C двое суток. Через два дня отмечают колонии гистидиновых ревертантов. Чтобы выяснить, нуждается ли исследуемое вещество в предварительной активации, имеет смысл проводить исследования как в присутствии, так и в отсутствие микросомальной активирующей системы, содержащей фракцию Sg.
Помимо опытных чашек должны быть и контрольные, содержащие:
а) только культуру бактерий и растворитель;
б) культуру бактерий, растворитель и микросомальную активирующую систему, содержащую фракцию Sg;
в) культуру бактерий с добавлением мутагенов и промутагенов, указанных выше (п. 7.2.2.1, Реактивы):
для штамма ТА 100 - цилофосфамида - 500 мкг на чашку;
для штамма ТА 98 - бенз-а-пирена - 10 мкг, 9-аминоакридина - 10 мкг на чашку.
В качестве промутагенов для штаммов ТА 98 и ТА 100 используются 2-ацетиламинофлуоредин и 2-аминофлуорен соответственно.
Степень мутагенного эффекта определяют по кратности превышения числа колоний реверантов при данной дозе над таковым в контроле. При сравнении числа колонии на опытных и контрольных чашках могут быть получены следующие результаты, представленные в таблице 7.2.2.
Таблица 7.2.2
Учет мутагенности
|
Отношение числа колоний в опыте и в контроле
|
Характеристика мутагенности
|
Обозначение
|
|
Менее 2,5
|
Отсутствие мутагенности
|
-
|
|
Менее 10
|
Слабая мутагенность
|
+
|
|
10 - 100
|
Средняя мутагенность
|
++
|
|
100 и более
|
Сильная мутагенность
|
+++
|
Методы статистической обработки полученных результатов приведены в приложении 4 данных Методических указаний.
7.3. Выявление хромосомных мутаций
7.3.1 Определение хромосомных аберраций в эпителии хрусталика глаза рыб
7.3.1.1. Характеристика тест-объекта. Исследования проводятся на видах рыб, у которых нет резкого падения митотической активности в осенне-зимний период. Для исследований подходят сеголетки и годовики обыкновенного окуня и радужной форели. Можно использовать другие виды рыб, не прекращающие активно питаться в естественных водных объектах зимой. Для морских рыб получены первые результаты исследований на покатниках семги, а также на морской камбале.
7.3.1.2. Лабораторное оборудование и материалы:
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
микроскальпель;
препаровальная игла с трехгранным сечением;
препаровальная игла с тонким изогнутым концом типа "кочерги";
обычная препаровальная игла;
пинцет с тонкоотточенными и изогнутыми концами;
глазные ножницы;
гистологическая проводка от дистиллированной воды до ксилола, с присутствием дополнительных стаканчиков с 30% и 50% этиловым спиртом;
банка с притертой пробкой для фиксации препаратов глаз;
обезвоженный медный купорос;
этиловый спирт;
ледяная уксусная кислота;
краситель - гемалаун Майера либо другой краситель (для ядер и хромосом, в зависимости от поставленной задачи).
7.3.1.3. Проведение исследований
а. Без предварительной травматизации хрусталика глаза. Рыбы выдерживаются в исследуемых концентрациях токсиканта. Возможно проведение подострых и хронических опытов. После экспозиции в растворах вещества рыб забивают декапитацией. У них извлекают глаза, которые помещают в фиксатор из смеси абсолютного этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Глаза могут помещаться в марлевый мешочек с этикеткой на дно банки с фиксатором. Банку на 1/4 заполняют обезвоженным медным купоросом. Продолжительность фиксации 24 ч. После фиксации глаза рыб обрабатываются поочередно.
Глаза из фиксатора перемещают в дистиллированную воду на 20 минут. По мере обводнения они опускаются на дно стакана с водой. После положенного срока поочередно каждый глаз помещают на ладонь вниз роговицей и вверх отверстием зрительного нерва. Глазными ножницами срезают дно глаза так, чтобы в образовавшееся отверстие мог пройти хрусталик. Хрусталик при этом становится видимым, но повернут к препаратору задним полюсом. В задний полюс вводят иглу с трехгранным сечением до упора в ядро хрусталика. Хрусталик изымается из глаза.
Дальнейшие операции сводятся к снятию передней капсулы хрусталика с эпителием и к получению плоскостного препарата из снятой с хрусталика полусферы. Сразу же после изъятия хрусталика из глаза трехгранной иглой, которая не дает возможности ему вращаться по оси, хрусталик перемещают в каплю дистиллированной воды. В этой капле микроскальпелем по экватору хрусталика делают надрез и переднюю капсулу с эпителием помещают с волоконной частью глазной линзы в воду. Наряду с капсулой на предметном стекле в капле воды могут оказаться фрагменты волокон хрусталика, частицы сетчатки и радужной оболочки.
Необходимо подготовить другое предметное стекло с каплей воды, в которую микропинцетом или обычной препаровальной иглой переносят капсулу хрусталика с эпителием.
Далее микроскальпелем наносятся насечки от периферии к центру полусферы капсулы хрусталика. Обычно бывает достаточно 5 - 6 глубоких насечек, чтобы полусферическую переднюю капсулу хрусталика можно было бы уложить в одной плоскости на предметном стекле. Отдельные части капсулы расправляют препаровальной иглой и "микрокочергой". Одновременно удаляют оставшиеся на эпителии волокна хрусталика. После первого расправления вода частично отсасывается фильтровальной бумагой.
Отдельные лепестки капсулы после насечек должны подворачиваться внутрь. Это гарантирует то, что эпителий хрусталика оказывается между стеклом и капсулой. В этом случае плоскостной препарат приклеивается к предметному стеклу при частичном подсушивании.
Дальнейшие операции сводятся к подсушиванию фильтровальной бумагой плоскостного препарата эпителия хрусталика и к частичному выправлению капсулы, она присушивается к стеклу, но не доводится до полного высыхания. Побелевшую, но еще влажную капсулу закрывают каплей красителя (при использовании красителя гемалаун Майера процесс окрашивания длится 5 - 8 мин.). При окраске гемалаун Майера препарат помещают в водопроводную воду, отмывают от красителя и проявляют там до подсинения.
После окраски препарата на предметном стекле его проводят через спирты, доводят до ксилола и заключают в канадский бальзам или в другую синтетическую среду.
Подсчет хромосомных аберраций проводят по методике, описанной на стадиях ана-телофазы в клетках эпителия как для всего хрусталика, так и для отдельных зон цитодифференцировки эпителия: центральной, герминативной и предэкваториальной. Высокая митотическая активность в герминативной и предэкваториальной зонах позволяет более полно выявить хромосомные мутации по сравнению с исследованием на других тканях.
б) Исследование с предварительной травматизацией хрусталика. Рыбы после экспозиции в растворах токсикантов за двое суток до приготовления препаратов эпителия хрусталика подвергаются травматизации уколом. Укол наносят тонкой энтомологической иглой в передний полюс хрусталика на 1/5 его диаметра. В первые сутки травматизацией гасятся спонтанные митозы в эпителии хрусталика, а затем появляются синхронизированные посттравматические митозы, полоса которых повторяет конфигурацию травмы. Таким образом, хромосомные аберрации на стадии ана-телофазы подсчитываются в посттравматических, синхронизированных митозах. Приемы подготовки препаратов эпителия хрусталика не отличаются от вышеописанных.
7.3.2. Определение частоты хромосомных аберраций в клетках жаберного эпителия рыб
Исследования проводят с аквариумной рыбой нотобранхиус (Nothobranchius rachovi). Метод позволяет учитывать частоту структурных нарушений хромосом на стадии метафазы и предполагает более полную оценку аберраций в качественном и количественном отношениях.
7.3.2.1. Характеристика тест-объекта. Нотобранхиус (Nothobranchius rachovi) имеет размер 3 - 4 см, имеет сравнительно небольшое количество хромосом (16), у которой в тканях отмечается высокая митотическая активность. Рыба легко воспроизводится и достаточно неприхотлива при содержании.
7.3.2.2. Лабораторное оборудование и материалы:
холодильник для хранения фиксированного материала;
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз с фотонасадкой;
мерная посуда для приготовления растворов;
флаконы (по 10 мл) для хранения фиксированного материала;
вегетационные сосуды для рыб;
предметные стекла;
препаровальные иглы;
пинцеты;
скальпель;
шприцы и иглы для инъекций;
краситель Гимза;
фиксатор (спирт/96%-ная ледяная уксусная кислота 3:1);
колхицин (0,4%);
гипотонический раствор KCl (0,4%);
уксусная кислота (60%).
7.3.2.3. Проведение исследований
Для учета средней частоты структурных перестроек хромосом используются клетки жаберного эпителия, богатые митозами.
Рыбе инъецируют внутримышечно 0,4% раствор колхицина и, умертвив ее через 5 - 6 часов, отделяют жабры, которые выдерживают в течение 20 минут в 0,4% растворе KCl, фиксируют в этанол-уксусной смеси (3:1) и мацерируют ткань в 60%-ной уксусной кислоте. Клеточную суспензию наносят на предметные стекла, высушивают, окрашивают раствором Гимза.
Для анализа выбираются метафазные пластинки с явно выраженными хромосомами, располагающимися в одной плоскости без наложений.
Для каждой рыбы анализируют до 40 метафаз. Независимо от числа аберраций в одной клетке они засчитываются как одно нарушение.
Учитывают следующие виды нарушений:
а) структурные хромосомные аномалии, включающие хромосомные и хроматидные разрывы, фрагменты, дицентрики, кольцевые хромосомы, ацентрические фрагменты;
б) анеуплоидные клетки;
в) полиплоидные клетки.
Подсчитывают на одну особь количество нормальных метафаз и клеток с аберрациями хромосом, рассчитывают процент нарушений (N) по следующей формуле:
число клеток с нарушениями
N = ------------------------------------- x 100%.
общее число проанализированных клеток
Вычисляют среднее арифметическое из N для каждой группы рыб.
7.4. Учет частоты образования микроядер в эритроцитах рыб
Метод позволяет учитывать в цитоплазме эритроцитов рыб частоту образования микроядер, которые представляют собой фрагменты ядерного материала, элиминирующиеся из ядра клетки при аберрациях митотических хромосом.
7.4.1. Проведение исследований
7.4.1.1. Оборудование и материалы:
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз с фотокамерой;
мерная посуда для приготовления растворов;
предметные стекла;
вегетационные сосуды для рыб;
краситель Гимза;
этиловый спирт (96%) для фиксации.
7.4.1.2. Подготовка мазков крови
Для приготовления мазков кровь берут из хвостовой вены. Мазки фиксируют в чистом этаноле, высушивают, окрашивают 10%-ным раствором красителя Гимза и просматривают под микроскопом.
7.4.1.3. Учет и анализ результатов
Анализу подлежат мазки, где клетки располагаются равномерно, образуя монослой без наложений и повреждений цитоплазмы. Учитываются только целые эритроциты.
Для определения частоты встречаемости клеток с одним или двумя микроядрами анализируют 1000 эритроцитов на особь на 1 предметное стекло. Перед подсчетом стекла можно шифровать.
7.5. Микроядерный тест на эпителии гуппи
7.5.1. Характеристика тест-объекта
С целью выявления тест-реакции на индукцию микроядер можно использовать покровный эпителий гуппи.
Применение метода обосновано тем, что во время деления клеток ацентрические фрагменты хромосом и отставшие хромосомы не входят в дочерние ядра, а формируют в цитоплазме одно и реже два ДНК-содержащих образования, получивших название микроядра. Микроядра представляют собой округлые образования в цитоплазме, имеющие темную окраску, сходную с окраской ядер исследуемых клеток. Размеры микроядер изменяются от 1/5 до 1/20 размера ядра.
7.5.2. Оборудование и материалы:
аквариумы емкостью 5 л;
микрокомпрессоры;
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
чашки Петри;
покровные и предметные стекла, пипетки объемом 1 - 5 мл;
препаровальные иглы;
микроскальпели;
глазные пинцеты;
счетчик для подсчета форменных элементов крови.
7.5.3. Проведение исследований
Для выявления микроядер используют те же методики, что и для выявления хромосомных аберраций (п. 7.3.1 Раздела 7). В препаратах определяют количество клеток с микроядрами на 1 тыс. подсчитанных клеток и выражают их число в процентах.
При этом учитывают на временно окрашенных препаратах появление микроядер в клетках эпителия в опыте и контроле.
7.5.4. Учет и анализ результатов
Критерием генотоксичности вещества является статистически достоверное увеличение числа клеток, содержащих микроядра в опытных препаратах по сравнению с контролем.
7.6. Определение генотоксичности вещества по действию на дифференциальную активность генов
7.6.1. Характеристика тест-объекта
Исследования проводятся на политенных хромосомах в слюнных железах предкуколки хирономид. В качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид - хирономус тами и хирономус плумозус (Chironomus thummi и Ch. Plumosus). При исследовании вещества в соленой воде в качестве тест-объекта рекомендуется лабораторная культура хирономид (Chironomus sp.) из азовских лиманов, адаптированная к солености 20 промилле. В результате проведения работы выявляется действие веществ на структуру интерфазных хромосом и на дифференциальную активность проявления пуффинга в процессе метаморфоза личинки в куколку.
7.6.2. Оборудование и материалы:
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
тонкий пинцет;
препаровальные иглы;
предметные и покровные стекла;
кисточка;
фильтровальная бумага;
краситель ацетоарсеин (0,5% арсеина в 45%-ной уксусной кислоте);
среда для заливки (краситель, разведенный в соотношении 1:3 45%-ной уксусной кислотой).
7.6.3. Проведение исследований
Определение генотоксичности химических соединений и их действия на дифференциальную активность генов проводят на предкуколке, развитие которой наблюдается с 36-го по 38-й день при температуре 20 - 25 °C. Стадия предкуколки характеризуется набуханием грудных сегментов, укорочением и заострением тела и уменьшением ложных ножек. Метаморфоз проходит в 6-й, 7-й, 8-й и 9-й фазах развития. Изменение цвета тела с красного на темно-серый указывает на окончание метаморфоза.
Для синхронизации развития и отбора хирономид в эксперименте заранее следят за степенью потемнения головы на первой фазе четвертого возраста, перед тем как личинка перейдет в фазу предкуколки. Отбирают личинок, у которых красный цвет головы меняется на темно-коричневый, и затем ждут момента набухания грудных сегментов и укорачивания тела. Препараты политенных хромосом из слюнных желез получают следующим образом. Личинку помещают на фильтровальную бумагу для обсушивания, затем переносят на предметное стекло, тонко отточенным пинцетом берут за мандибулы и тянут, отрывая голову. Вместе с головой из тела вытягивается кишечник, по бокам которого видны слюнные железы, прикрепленные к голове протоками. Препаровальными иглами слюнные железы отделяют от остальных тканей и окрашивают их в течение 10 - 15 мин. ацетоорсеином. После окрашивания слюнные железы изымают из красителя и помещают на чистое предметное стекло. На покровное стекло наносится капля среды для заливки. Покровное стекло переворачивают так, чтобы капля покрыла слюнные железы. На покровное стекло помещают кусочек фильтровальной бумаги и большим пальцем, без сдвигов в стороны, клетки слюнных желез раздавливают. Среда для заливки, выступившая из-под покровного стекла, впитывается в фильтровальную бумагу. Затем бумагу удаляют, а края покровного стекла смазывают бесцветным лаком. Благодаря лаку препарат предохраняют от высыхания.
7.6.4. Учет и анализ результатов
Генотоксичность вещества оценивается по нарушению структуры политенных хромосом (возможны разрывы, распад концов и дезинтеграция) и по нарушению пуфинга во время метаморфоза. Отмечается следующее образование пуфов в норме. На первой хромосоме пуф Gih-к увеличивается в размерах на 7-й и 8-й фазах развития. На второй хромосоме 2Азв постепенно сужается, а пуф 2Азе увеличивается на каждой последующей фазе. На 8-й фазе появляются 2 пуфа 2Д2де и пуф 2Г2. На третьей хромосоме на 6-й и 7-й фазах имеется пуф 3Дih, а после 7-й фазы появляется пуф 3Дif, который отмечается до конца метаморфоза. На четвертой хромосоме видны тельца Бальбиани, которые резко увеличиваются на 8-й фазе. Помимо этого на 6-й фазе появляется быстро исчезающий пуф 4Дс.
При действии некоторых токсикантов у личинок насекомых, имеющих политенные хромосомы, может возникнуть до 22 новых пуфов.