5.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО РАЗРАБОТКЕ НОРМАТИВОВ КАЧЕСТВА ВОДЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ НОРМАТИВОВ ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ В ВОДАХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННОГО ЗНАЧЕНИЯ

5.1.1. Характеристика тест-объекта

Брюхоногие моллюски играют важную роль в круговороте органического вещества в водных экосистемах. Прудовик болотный (обыкновенный, большой) Limnea stagnalis является представителем эпибентоса. Широко распространен в прибрежной зоне стоячих или медленно текущих водных объектов.

Прудовиков отлавливают в летние месяцы на мелководьях эвтрофных водных объектов в зарослях высшей водной растительности.

5.1.2. Условия лабораторного содержания

Для содержания моллюсков и для проведения исследований необходимо следующее оборудование:

микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;

бинокулярная лупа;

весы аналитические с разновесами;

весы технические;

термостат на 150 °C;

муфельная печь на 450 °C; кристаллизаторы на 2 л;

стаканы химические на 100 - 500 мл;

колбы мерные на 0,2 - 1 л;

цилиндры мерные на 50 - 1000 мл;

пипетки химические на 1 - 10 мл;

чашки Петри;

респирометры (банки по 0,5 л со стеклянными крышками);

склянки с притертыми пробками на 0,5 - 1 л для растворов;

сифоны с зажимами Мора;

пикнометры;

тигли;

ножницы, пинцеты, часовые стекла;

реактивы для определения кислорода методом Винклера.

Для исследований отбирают половозрелых моллюсков, активно передвигающихся и потребляющих корм. Кормят листьями одуванчика, капусты, салата, рдестом блестящим. Корм моллюскам дают в изобилии, что положительно сказывается на их росте и продуктивности. В каждый кристаллизатор помещают по 3 - 5 особей. После отбора проводят адаптацию к условиям лабораторного содержания в течение двух недель.

5.1.3. Проведение исследований

Для каждого опыта выбирают особей одного размера, веса и цвета раковины.

Острый опыт предназначен для определения диапазона концентраций хронического опыта. Проводится при 5 - 6 концентрациях в трех повторностях каждая. Концентрации различаются между собой на порядок. Продолжительность исследования - 3 - 5 суток. Моллюсков в опыте не кормят. В каждый кристаллизатор на 1,5 - 2,5 дм3 раствора помещают 3 - 5 моллюсков.

Учитывают влияние исследуемого вещества на выживаемость и поведение моллюсков.

Хронический опыт продолжается 45 - 60 суток. Исходной концентрацией для длительных исследований служит наибольшая безвредная концентрация, определенная в остром опыте. Число повторностей и плотность посадки такие же, как и в остром опыте. В течение опыта моллюсков подкармливают.

Состояние выборок учитывают ежедневно.

Для оценки влияния вещества на процессы размножения в аквариумы помещают по 2 - 3 взрослых прудовика. Ежедневно учитывают появление кладок, начало выклева и время появления молоди, которая содержится в аквариуме. Через 3 - 4 месяца всю молодь изымают из аквариумов и промеряют под микроскопом с помощью окуляр микрометра по высоте и ширине раковины. Мелкие особи держатся у уреза воды, быстро обсыхают и могут быть утеряны при подсчете численности. Необходимо регистрировать и погибших моллюсков, учитывая пустые раковины.

5.1.4. Учет и анализ результатов

В первые 8 ч ежечасно, а в последующие 3-е суток 2 - 3 раза в день учитывают состояние моллюсков в опытных и контрольных сосудах. Регистрируют количество живых особей и их поведение (степень и характер передвижения, выдвижение ноги и ее реакцию на раздражение), интенсивность потребления корма, выделение слизи, определяемое по помутнению опытного раствора. В дальнейшем учет проводят один раз в сутки.

Особи, которые не реагируют на механическое раздражение и тело которых легко высвобождается из раковины, считаются погибшими.

Размножение и плодовитость оценивают по времени появления первых кладок, их числу и количеству яиц в каждой кладке. Потенциальную плодовитость определяют по числу яиц в кладках, полученных от каждого моллюска за период опыта, а реальную - по количеству выклюнувшейся молоди в абсолютных величинах и процентах к исходному числу яиц в кладках. Помимо этого можно контролировать процесс эмбриогенеза (время начала и конца прохождения каждой стадии, состояние эмбрионов) вплоть до выклева молоди. Особенности роста оценивают, определяя высоту и ширину раковины, отношение высоты к ширине. Водно-солевой обмен моллюсков оценивают, определяя сырую массу тела и раковины, массу полостной жидкости и воды в теле, сухой остаток и количество золы в мягких тканях. По разнице сухого остатка и сырой массы тела судят об изменении степени обводненности, а по количеству зольных элементов в теле и массе раковины - об изменении минерального обмена.

Высоту и ширину раковины измеряют штангенциркулем. За ее высоту принимают расстояние от вершины раковины до наиболее выступающего края устья, а за ширину - диаметр раковины в наиболее широкой части.

Для определения общей массы прудовика обыкновенного его обсушивают фильтровальной бумагой и, не надавливая на ногу (для сохранения в раковине полостной жидкости), переносят на технические весы и взвешивают.

При определении массы тела и раковины ножницами разрезают раковину по швам витков, освобождают тело, обсушивают на фильтровальной бумаге и взвешивают на аналитических весах (с точностью до 0,001 грамма). Тела особей каждой размерной группы фиксируют в бюксах в 96% этаноле. Осколки раковины взвешивают. Вычитая из общей массы массу тела и раковины, определяют количество полостной жидкости.

Для определения сухого остатка тела вес зафиксированных в спирте моллюсков доводят до постоянной величины при температуре 103 - 105 °C. Количество сухого остатка рассчитывают на единицу сырой массы. По разности сырой и сухой массы определяют количество воды в теле прудовика и судят о степени обводненности или обезвоживания тела под воздействием химического вещества.

Сухой остаток тела прудовика (весь или его часть) переносят в тигли и сжигают в муфельной печи при температуре 450 °C. Рассчитывают количество золы на единицу массы сухого остатка тела. По количеству золы судят об изменении минерального обмена.

Количество органического вещества рассчитывают по разности массы сухого остатка и золы. Эта величина, при сравнении с контрольными величинами, указывает на степень энергетических затрат организма при токсическом воздействии.

Для определения суточного рациона моллюсков находят разность между начальным количеством корма и его остатком. Задаваемую порцию корма взвешивают, а остаток изымают, обсушивают и вновь взвешивают. Для каждой размерной группы вычисляют кормовой коэффициент по формуле:

К = P / ДельтаP,

где P - масса съеденного корма (г), ДельтаP - прирост массы моллюска (г).

Этот показатель позволяет судить об эффективности потребленного корма моллюсками при токсическом воздействии в опыте по сравнению с контролем.

Изучение энергетического обмена у прудовиков заключается в определении интенсивности потребления кислорода с применением метода Винклера (или с использованием чувствительного оксиметра).

Для этого в респирометры (банки на 0,5 дм3 с плотными крышками) заливают воду, помещают прудовиков, у которых предварительно определены масса и объем тела (по 3 особи), и закрывают крышками так, чтобы в банках не оставалось воздушных пузырьков. Банки с водой, но без моллюсков являются контрольными. Банки при стабильной температуре выдерживают 2 ч, после чего из них отбирают пробы воды в калиброванные пикнометры, в которых измеряют количество растворенного кислорода. Количество кислорода, потребленное прудовиками (в мг кислорода на 1 дм3 за 1 ч), определяют по формуле:

               M мг/дм3 x ч = (m  x m) x (V  - V ) / P x t,
                                0          1    2

    где  m   -  содержание кислорода, растворенного в воде респирометра без
          0
прудовиков,  мгO  на 1 см3; m  - содержание кислорода в воде респирометра с
                2            1
прудовиками; V  - объем респирометра в см3; V  -  общий объем тел моллюсков
              1                              2
в мл; P - общая масса тел прудовиков в мг; t - продолжительность экспозиции
в часах.

При наличии оксиметра контроль содержания кислорода в воде можно производить непосредственно в респирометрах, не отбирая проб.

Полученные результаты по динамике роста молоди прудовика заносят в нижеследующую табличную форму 6.

Форма 6

Результаты учета динамики роста молоди прудовиков

По окончании экспериментов с прудовиком и обобщении полученных данных допустимыми следует считать такие концентрации вещества, которые:

а) не вызывают статистически достоверного отклонения выживаемости взрослых моллюсков и молоди от выживаемости в контроле в срок до 60 суток;

б) не вызывают достоверного угнетения размножения моллюсков за срок наблюдения;

в) не снижают интенсивность потребления кислорода более чем на 15% по сравнению с контролем (то, что отмечено выше красным шрифтом);

г) изменяют водно-солевой обмен по сравнению с контролем не более чем на 10%.