2.1. Элодея
2.1.1. Характеристика тест-объекта
Элодея (Elodea canadensis Rich.) - представитель погруженных растений, широко распространенный в пресноводных водных объектах умеренной зоны.
Размножается вегетативным путем за счет образования густо облиственных боковых отростков, побегов из подземных частей (корневищ) или из нижних частей летних побегов. Теневынослива. Температурная граница выживаемости лежит в пределах от +5 °C до 41,5 °C.
Для культивирования растения отбирают из естественной популяции условно чистого водного объекта в конце мая - начале июня, когда появляется много молодых, наиболее жизнеспособных растений.
У элодеи отбирают зеленые верхушечные побеги длиной 8 - 10 см без боковых отростков и корней, не имеющие видимых повреждений.
Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта.
2.1.2. Условия лабораторного содержания
В лаборатории элодею размещают в большие широкие, но не глубокие емкости (10 - 15 дм3). Растения проходят акклимацию при комнатной температуре в течение 7 - 10 дней, достаточной освещенности (лучше - в люминостатной установке) и при смене воды каждые 2 - 3 суток.
Для работы с растениями необходимо следующее оснащение:
люминостатная установка;
круглые аквариумы на 10 - 15 л;
кристаллизаторы объемом 1 л;
стаканы объемом 0,5 л;
люксметр;
термометр;
линейка;
глазной пинцет, лезвие;
воронка, набор пипеток, стеклянная палочка;
планктонный газ N 68, фильтровальная бумага.
Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязняемого водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной продувкой воздуха.
Для исследований воду используют через 4 - 5 дней.
Сосуды располагают у окон на дневном рассеянном свету (с южной стороны) или в люминостате при освещенности 1,5 - 2 лк на протяжении 10 - 12 ч и при температуре 22 - 25 °C. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром.
В воду добавляют среду Успенского N 1 (разведение 1:10), которая способствует быстрому образованию боковых отростков и увеличению биомассы растения и дает возможность круглогодичного содержания растений, пригодных для экспериментов.
Предварительно приготовленные основные растворы держат в холодильнике, затем из них вносят по 0,5 см3 на 1 дм3 дистиллированной воды; pH после стерилизации раствора (равномерным кипячением в течение 0,5 ч) составляет 7,0 - 7,3.
2.1.2.1. Проведение исследований
Для экспериментов используют верхнюю часть побега элодеи длиной 4 см без боковых отростков и корней и по 5 экземпляров помещают в кристаллизаторы с растворами исследуемого вещества и с водой без токсиканта объемом по 1 дм3. Для каждой концентрации и для контроля используют по три таких сосуда. Сосуды размещают в люминостате или у окон на дневном рассеянном свету с досвечиванием лампами дневного света при температуре 17 - 22 °C и освещенности до 2 лк.
До проведения хронического эксперимента следует в предварительном
10-дневном опыте установить диапазон действующих концентраций вещества. Из
раствора, вызывающего гибель половины особей (ЛК ) за 10 суток, для
50
проведения хронического опыта готовят не менее 3 - 6 разведений,
различающихся между собой на порядок.
Опыты продолжительностью не менее 30 суток наиболее удобно проводить в летний период. Смену всех растворов и воды в контроле проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2 - 5 суток.
Состояние выборок учитывают каждые 5 суток.
2.1.2.2. Учет и анализ результатов
Оценку токсичности веществ для элодеи осуществляют по следующим параметрам:
а) состояние растений (изменение окраски, потеря тургора, повреждение точек роста и др.);
б) выживаемость и прирост основного побега;
в) число боковых отростков и их длина;
г) число корней и длина.
Прирост основного побега элодеи определяют, вычитая исходные 4 см. Суммарный прирост растения составляется из суммы прироста основного побега и длины боковых отростков. Прирост выражают в сантиметрах, число боковых отростков и корней - в штуках (экз.).
У элодеи в лабораторных условиях боковые отростки и корни появляются, как правило, на 10 - 20 сутки. Отмечают время их появления. Прирост, число и длину боковых отростков и корней рассчитывают на одно растение.
2.1.3. Ряска малая
2.1.3.1. Характеристика тест-объекта
Ряска малая (Lemna minor L.) - представитель группы растений с плавающими листьями. Тенелюбива, устойчива к низким температурам. Ее распространение ограничено участками водных объектов с pH от 6,2 до 7,5.
Для культивирования растения отбирают из естественной популяции водного объекта в конце мая - начале июня, когда много молодых, наиболее жизнеспособных растений. При отборе ряски выбирают растения с зелеными лопастями и с корнями, не имеющими видимых повреждений.
Отобранные растения транспортируют в сосудах с водой, взятой из того же водного объекта.
2.1.3.2. Условия лабораторного содержания
В лаборатории ряску помещают в кристаллизаторы объемом 1 дм3 с речной или отстоянной водопроводной водой. В течение 7 - 10 дней растения проходят акклимацию при комнатной температуре и при достаточной освещенности (лучше в люминостатной установке), со сменой воды каждые 2 - 3 суток для удаления продуктов метаболизма.
Для работы с растениями необходимо следующее оснащение:
люминостатная установка;
круглые аквариумы на 10 - 15 дм3;
кристаллизаторы объемом 1 дм3;
стаканы объемом 0,5 дм3;
люксметр;
термометр;
линейка;
глазной пинцет, лезвие;
воронка, набор пипеток, стеклянная палочка;
планктонный газ N 68, фильтровальная бумага.
Для проведения экспериментов и культивирования растений используют отстоянную водопроводную воду или воду из незагрязненного водного объекта. Природную воду процеживают через воронку диаметром 150 мм с планктонной сеткой (газ N 68) для удаления взвеси и мелких организмов, заливают в аквариум с постоянной аэрацией воды.
Для исследований воду используют через 4 - 5 дней.
Ряску в количестве 5 растений, имеющих одну сформировавшуюся и одну развивающуюся лопасть и корень с неповрежденным корневым чехликом, и примерно одинаковой длины, помещают в стаканы объемом 0,5 дм3 и размещают в люминостате при температуре 22 - 25 °C и освещенностью 5 лк. Для измерения температуры раствора рядом ставят стакан с водой и термометром.
Для круглогодичного культивирования ряски в целях получения достаточного количества материала рекомендуют выращивать их на среде Гапоненко-Стажецкого при круглосуточном освещении 7 - 8 лк и температуре +25 °C.
Состав среды Гапоненко-Стажецкого:
KNO - 0,4 г/л,
3
KH PO - 0,2 г/л,
2 4
MgSO -7H O - 0,3 r/n,
4 2
CaCl - 6H O - 0,6 г/л,
2 2
MnCl -4H O - 0,3 г/л,
2 2
H BO - 0,5 мг/л,
3 3
цитрат железа - 5 мг/л.
Среду автоклавируют при 1,5 атм. в течение 20 минут, цитрат железа вносят после стерилизации.
2.1.3.3. Проведение исследований
До постановки хронического эксперимента следует провести предварительный 10-дневный опыт для установления диапазона действующих концентраций вещества. Для каждой концентрации и контрольной выборки отводят по 3 стакана.
Для проведения хронического опыта из концентрации, вызывающей за 10 суток гибель 50% особей, готовят не менее 3 - 6 разведений, отличающихся на порядок.
Хронические опыты продолжительностью не менее 30 суток наиболее удобно проводить в летний период. Растения по 5 экземпляров рассаживают в стаканы (объем 0,5 дм3), которые размещают в люминостате или на рассеянном свету при температуре 22 - 25 °C и освещенности 3 - 4 лк.
Смену опытных растворов проводят (в зависимости от стабильности вещества) через 2 - 5 суток, одновременно меняя воду и в контроле.
2.1.3.4. Учет и анализ результатов
Состояние растений учитывают каждые 5 суток по выживаемости и изменению ряда биологических показателей.
Отмечают общее состояние растений (изменение окраски, размер лопастей, состояние корней), число растений, лопастей и корней в штуках. Общее число лопастей составляет суммарный прирост ряски.
Измерения длины проводят с помощью линейки.
Все результаты измерений пересчитывают на одно растение.
Учитывают сроки образования новых лопастей и корней, а также новых растений, которые приходятся примерно на 10 - 20-е сутки.