1. Установление максимальной допустимой концентрации вещества для одноклеточных водорослей
1.1. Введение
Планктонные одноклеточные водоросли (фитопланктон), как и высшие водные растения, представляют в водных экосистемах группу организмов-продуцентов.
Из двух видов рекомендуемых одноклеточных водорослей (п. 2 Приложения 2) для исследований может быть выбран один, в зависимости от возможностей и традиций лаборатории. Другие виды водорослей могут быть использованы только в дополнение к обязательным видам.
Для экспериментов используют культуру водорослей в экспоненциальной фазе роста. Большое значение имеет физиологическое состояние культуры, проверяемое по эталонному (стандартному) веществу.
Оценка влияния вещества на одноклеточные водоросли оценивается по показателям изменения численности клеток водорослей (снижение или увеличение) в опытной среде по сравнению с контролем.
Достоверное снижение численности клеток водорослей в растворе вещества является показателем токсического действия раствора вещества.
Критерием эвтрофирующего эффекта вещества является достоверное увеличение численности клеток водорослей в различных концентрациях вещества. Лимитирующий показатель вредности в данном случае - санитарный.
Наряду с изучением динамики численности водорослей к регистрируемым показателям в опыте следует относить изменение pH; визуальные наблюдения за состоянием культуры водорослей: изменения в окраске, форме клеток и состоянии суспензии (взвешенное, опускание на дно, всплывание к поверхности, гомогенность или агрегация) по сравнению с контролем.
В качестве экспресс-метода оценки токсичности (эвтрофирования) химического вещества можно использовать приборный метод быстрой или замедленной флуоресценции водорослей (Минрыбхоз СССР введены в действие методические разработки ВНИРО от 18 декабря 1987 г. N 291-ц "Методические рекомендации по экспрессному биотестированию природных и сточных вод с использованием замедленной флуоресценции одноклеточных водорослей". М.: ВНИРО, 1987). Показания изменения флуоресценции водорослей в растворах вещества по отношению к контролю следует относить к основным показателям, характеризующим процессы жизнедеятельности одноклеточных водорослей. Показания быстрой и замедленной флуоресценции относятся только к живым клеткам, отражают интенсивность процесса фотосинтеза водорослей, по калибровочной кривой позволяют определить количество живых клеток в эксперименте.
Кратковременная оценка токсичности раствора вещества - до 24 - 96 ч - позволяет определить наличие острого токсического действия вещества на одноклеточные водоросли, а длительное исследование - до 14 суток - его хроническое токсическое действие.
К дополнительным показателям при исследовании следует относить: оценку биомассы водорослей (полученную расчетным методом), оценку скорости и темпа деления клеток (расчет генераций), содержание фотосинтезирующих пигментов (хлорофилла и каротиноидов), соотношение живых и мертвых клеток водорослей (используя люминесцентный микроскоп или различные витальные красители - цитохимический метод).
1.2. Характеристика тест-объекта
В качестве основных стандартных тест-объектов используются лабораторные альгологически чистые монокультуры одноклеточных зеленых водорослей сценедесмус и хлорелла, относящиеся к родам сценедесмус (Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb., S. acuminatus (Lagerh.) Chod) и хлорелла (Chlorella vulgaris Beyer, Chl. pyrenoidosa Chik). Чаще других в лабораторной практике используют виды S.quadricauda и Chl.vulgaris (сценедесмус квадрикауда и хлорелла вульгарис).
Сценедесмус широко распространен в водных объектах России и имеет относительно крупные удлиненно-овальные клетки с закругленными концами. Размер клеток 7 - 43 x 2,5 - 16 мкм. Клетки неподвижные, собранные в виде плоских пластинок (ценобии) по 2-, 4-, реже 8, 16 клеток. Размножение автоспорами. Автоспоры в материнской оболочке располагаются пучком, после освобождения разворачиваются в виде пластинки. В условиях культуры вместо ценобиев образуются отдельные клетки.
Хлорелла распространена в водных объектах южных широт (диаметр клеток 4,2 - 10,5 мкм). Клетки одиночные, шаровидные, с тонкой оболочкой, без слизи. Хроматофор чашевидный, с пиреноидом. Размножение автоспорами, образующимися по 4 - 8, реже 16 и освобождающимися через разрыв материнской оболочки. Диаметр клеток 4,2 - 10,5 мкм.
После пересева культур на новую среду экспоненциальная фаза роста наступает на 4 сутки.
Численность клеток за 3 суток увеличивается не менее чем в 3 раза.
1.3. Условия лабораторного содержания одноклеточных водорослей.
Используется обычное лабораторное оборудование, приборы, посуда и реактивы, в том числе:
фильтровальная установка любого типа;
фильтры мембранные (размер пор 3,5 мкм, 0,45 мкм);
пипетки автоматические - дозаторы объемом 0,1, 0,2 см3;
камера счетная Горяева или Фукс-Розенталя;
предметные и покровные стекла;
климатостат (люминостат) любого типа, оснащенный лампами дневного света 3000 - 6000 лк, обеспечивающий поддержание температуры (20 +/- 2) °C;
спиртовка;
pH-метр;
оксиметр любого типа с погрешностью измерения не более 0,5 мг/дм3;
микроскоп биологический, обеспечивающий увеличение в 100 - 200 раз;
стаканы стеклянные лабораторные объемом 100, 500, 1000 см3;
колбы конические емкостью 50, 100, 250, 1000 см3;
эталонное (стандартное) химическое вещество: калий двухромовокислый (бихромат калия) или стандарт-титр калия двухромовокислого для проверки физиологической чувствительности культуры водорослей;
культуры зеленых одноклеточных водорослей Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb. и Chlorella vulgaris Beyer.
Культивируют водоросли (Таблица 1.3.1) на среде Прата или на среде Успенского N 1 (Утверждено Минприродой России от 27 апреля 2001 г. "Руководство по определению методов биотестирования токсичности вод, донных отложений, загрязняющих веществ и буровых растворов". М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2002).
Таблица 1.3.1
┌──────────────────────┬──────────────────────┬───────────────────────────┐ │ Компоненты среды │ Концентрация в среде │ Концентрация исходных │ │ │ для культивирования, │растворов для приготовления│ │ │ г/дм3 │ среды, г/100 см3 │ │ ├─────────┬────────────┼────────────┬──────────────┤ │ │ Прата │ Успенского │ Прата │Успенского N 1│ │ │ │ N 1 │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │KNO │ 0,1 │ 0,025 │ 10,0 │ 2,5 │ │ 3 │ │ │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │MgSO · 7H O │ 0,01 │ 0,025 │ 1,0 │ 2,5 │ │ 4 2 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │Ca(NO ) ·4H O │ - │ 0,144 │ - │ 14,4 │ │ 3 2 2 │ │ │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │K HPO ·3H O │ 0,01 │ - │ 1,0 │ - │ │ 2 4 2 │ │ │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │KH PO ·3H O │ - │ 0,025 │ - │ 2,5 │ │ 2 4 2 │ │ │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │K CO │ - │ 0,0345 │ - │ 3,45 │ │ 2 3 │ │ │ │ │ ├──────────────────────┼─────────┼────────────┼────────────┼──────────────┤ │FeCl ·6H O │ 0,001 │ - │ 0,1 │ │ │ 3 2 │ │ │ │ │ └──────────────────────┴─────────┴────────────┴────────────┴──────────────┘
Питательные среды Прата и Успенского для культивирования водорослей готовят на дистиллированной воде. Чтобы избежать образования осадка в питательной среде, каждый ее компонент предварительно готовят отдельно в 100 см3 дистиллированной воды (исходный раствор). Исходные растворы хранят в холодильнике при температуре от +2 °C до +4 °C в течение месяца, в случае помутнения производят их замену.
Из исходных растворов каждого вещества (кроме солей железа) по 1 см3
добавляют в колбу объемом 1 дм3, наполовину наполненную дистиллированной
водой (добавление в последовательности расположения веществ в таблице
1.3.1). Доливают колбу дистиллированной водой до объема 1 дм3,
перемешивают, после чего питательную среду стерилизуют в автоклаве (30 мин.
при 1 атм.) или кипячением на водяной бане в течение 30 мин. После
охлаждения стерилизованной среды в нее добавляют соль железа в количестве
1 см3 на 1 дм3 среды (для среды Прата 1%-ный раствор FeCl ·6H O; для
3 2
среды Успенского 1% раствора одной из солей железа FeCl , Fe (SO ) ,
3 2 4 3
Fe(NH )(SO ) или цитрат железа).
3 4 2
Приготовленную среду хранят до использования в темном месте при комнатной температуре.
Культивируют водоросли в люминостате в конических колбах объемом 250 - 300 см3, закрытых фольгой или ватно-марлевым тампоном. Освещенность 3000 - 6000 люкс. Соблюдается световой суточный ритм. Культуру водорослей периодически перемешивают, встряхивая 1 - 2 раза в сутки. Температура при культивировании водорослей 20 +/- 2 °C.
Повышение температуры до 25 °C и выше усиливает токсическое действие, а понижение ее до 12 - 15 °C задерживает проявление эффекта и снижает действие вещества.
Водоросли рекомендуется один раз в десять дней пересевать. Для этого в чистую простерилизованную колбу объемом 250 см3 со свежей средой (100 - 150 мл) над пламенем спиртовки приливают примерно 15 - 20 см3 верхнего росткового слоя из колбы ранее культивируемых водорослей. При этом получают начальную плотность клеток в колбе для культивирования, примерно 300 тыс. кл/см3. Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном или фольгой, перемешивают, записывают на колбе название культуры, дату посева и ставят в люминостат. В течение дня содержимое колбы перемешивают 1 - 2 раза.
1.4. Проведение исследований
Опыты проводят при оптимальной температуре и освещении (п. 1.3 Приложения 2). Используют водоросли в экспоненциальной фазе роста, что соответствует трехсуточной культуре водорослей после пересева. Плотность культуры в колбе в это время достигает примерно 5 млн. кл/см3.
В опыте используют начальную плотность клеток 25 тыс. кл/см3. Для этого нужная плотность клеток в опыте достигается расчетом, исходя из объема тестируемой (контрольной, опытной) воды (например, 100 мл) и численности клеток в культуре в экспоненциальной фазе роста (примерно 5 млн. кл/см3). В указанном случае в опытную и контрольную воду добавляется по 0,5 см3 трехсуточной культуры водорослей.
Периодически (не реже 1 раза в месяц) необходимо проводить контроль
физиологической чувствительности водорослей. Для этого используют
стандартное (эталонное) вещество - двухромовокислый калий K Cr O марки
2 2 7
химически чистый ("хч") или стандарт-титр калия двухромовокислого.
Готовят маточный раствор двухромокислого калия концентрацией 1 г/дм3.
Далее методом разбавления - серию растворов с концентрациями 0,12; 0,25;
0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мг/л. Исследование проводят в течение 48 ч в трех
повторностях. По результатам опыта рассчитывают среднюю концентрацию
K Cr O , вызывающую уменьшение численности клеток на 50% за 48 ч (ЛК за
2 2 7 50
48 ч). Если полученное значение ЛК находится в интервале 1,3 - 2,5 мг/л,
50
то культура водорослей может быть использована для экспериментов.
Если полученные значения ЛК не попадают в указанный интервал, то
50
эксперименты с водорослями не проводят, выясняют причину (условия
культивирования, состав культуральной среды и проч.). Иногда культуру
водорослей заменяют и проводят эксперименты заново.
При постановке острых и хронических экспериментов в контрольные и опытные колбы емкостью 250 мл наливают по 100 мл (в колбы емкостью 100 мл - по 50 мл) контрольной среды или исследуемой концентрации вещества. Контролем служит культуральная среда, на которой культивируются водоросли (среда Прата или среда Успенского N 1). Концентрации веществ также готовят на соответствующей среде.
В опытные и контрольные колбы пипеткой добавляют по 0,5 см3 (0,25 см3) культуры водорослей в экспоненциальной фазе роста.
Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или фольгой, их содержимое тщательно перемешивают и в каждой колбе определяют исходную численность клеток, которая должна составлять 25 тыс. кл/см3. Колбы помещают в люминостат.
В эксперименте должно быть исследовано не менее 5 концентраций вещества. Повторность трехкратная.
Эксперименты на водорослях проводятся в 2 этапа: предварительный и основной (окончательный).
В предварительном остром эксперименте находят интервал токсичных концентраций. Опыты проводят в широком диапазоне концентраций вещества, которые отличаются в геометрической прогрессии (коэффициент 10). Например, 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/л и т.д. Исследуют не менее пяти концентраций в двух повторностях. По результатам эксперимента определяется диапазон концентраций для основного острого и хронического эксперимента.
В основном остром и хроническом эксперименте шаг между концентрациями изменяется в 2 - 5 раз. Исследуют не менее пяти концентраций в трех повторностях.
Подсчет клеток водорослей проводят в остром опыте ежедневно, в хроническом на 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14 сутки.
На 14 сутки от начала эксперимента опыт прекращают и устанавливают, оказывают ли исследуемые концентрации вещества хроническое токсическое или эвтрофирующее действие на водоросли.
1.5. Учет и анализ результатов
Основным критерием токсичности действия веществ на тест-объект следует считать изменение численности клеток водорослей, последовательность прохождения ими всех стадий развития и их способности к размножению.
Для подсчета численности клеток используют счетную камеру Горяева или счетную камеру Фукса-Розенталя.
При работе с камерой Горяева камеру и покровное стекло обезжиривают (промывают спиртом). Затем из колбы наносят пипеткой по капле суспензии водорослей на верхнюю и нижнюю сетки счетной камеры, накрывают камеру покровным стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции. Через 1 - 2 мин. начинают подсчет водорослей в 5 больших квадратах камеры, расположенных по диагонали сетки счетной камеры, или в 25 больших квадратах всей камеры при малой плотности водорослей. Под микроскопом просчет из каждой контрольной и опытной колбы проводят не менее трех раз.
По окончании эксперимента рассчитывают численность клеток водорослей в остром и хроническом опытах по сравнению с контролем (в том числе и в процентах).
Рассчитывают численности клеток на 1 см3 среды следующим образом:
4
количество клеток в 25 больших квадратах камеры Горяева умножают на 10 ,
получая количество клеток в 1 см3 суспензии.
Учет численности клеток можно также проводить в камере Фукса-Розенталя объемом 3,2 мл. При высокой численности клеток просчитывают по диагонали 16 квадратов, при малой - считают по всему полю камеры. Количество клеток также выражают в 1 см3. Расчет клеток производят по формуле:
3
m · 10
M = -------,
n · V
где М - количество клеток в 1 см3; m - количество просчитанных клеток (сумма); n - количество просчитанных маленьких квадратов камеры; V - объем части камеры, имеющей площадь маленького квадрата.
Результаты исследования учитывают, если численность клеток водорослей в контроле увеличивается за 96 ч не менее чем в 3 раза. При изменении численности клеток в контроле менее чем в 3 раза результаты опыта считаются недействительными.
Используя приемы статистической обработки, устанавливают достоверность различия (снижение или увеличение) численности клеток между опытом и контролем.
Численность живых и мертвых клеток определяют с помощью люминесцентной микроскопии. Ранжируя клетки по интенсивности свечения, можно установить время воздействия вещества на водоросли, степень и скорость отмирания.
На практике в основном различают три цвета - жизнеспособные клетки светятся ярким пурпурно-красным светом, отмирающие - различными оттенками тускло-красного или оранжево-красного тона, мертвые - желтовато-салатным. При подсчете клеток водорослей учитываются все три группы - живые, мертвые и отмирающие клетки. В стадии интенсивного роста клеток водорослей в культуре наблюдается минимальное присутствие мертвых клеток.
Помимо люминесцентной микроскопии разделение живых и мертвых клеток может проводиться путем микроскопии в видимой области с использованием специальных красителей.
Активная реакция среды - изменение pH среды служит интегральным косвенным показателем состояния культуры. Чем выше жизнеспособность водорослей, тем значительнее изменяется на свету реакция среды (подщелачивание) в результате фотосинтетической ассимиляции углекислоты. Измерение pH среды осуществляется с помощью pH-метра, что является обязательным в начале и конце опыта, при хроническом эксперименте - в дни учета биологических показателей.