3.2. Токсикологическое исследование
3.2.1. Необходимость исследования стабильности токсичности обусловлена тем, что химико-аналитические определения не позволяют оценить остаточную суммарную токсичность вещества и продуктов его превращения. Оценку остаточной токсичности проводят методами биотестирования. В качестве тест-объекта рекомендуется использовать организмы зоопланктона (например, одновозрастные дафнии - для пресноводных водных объектов). Возможно использование в качестве тест-объекта других представителей трофической цепи, например, рыб (личинки, мальки, сеголетки).
3.2.2. Исследованию подвергается одна концентрация вещества - ЛК за
50
24 ч, которая устанавливается для организма в соответствии с общими
требованиями для опытов на острую токсичность вещества (п. 4.1.4 Приложения
2 к настоящим Методическим указаниям).
3.2.3. Раствор вещества данной концентрации (ЛК за 24 ч) вносят в
50
восемь емкостей. Каждая емкость соответствует постановке эксперимента в
определенный день исследований.
3.2.4. На исходные (0) сутки, далее на 3, на 5, на 7, на 10, на 15, на 20 и на 30 сутки от начала эксперимента в соответствующие емкости вносят по одинаковому количеству тест-объектов (не менее 10 экземпляров). Перед каждым внесением тест-объектов в емкость с раствором емкость тщательно перемешивают. Через 24 ч после внесения организмов в емкость учитывают число погибших и удаляют их из емкости.
Опыты проводят в 3-кратной повторности. Каждому опыту соответствует контроль.
3.2.5. Полученные экспериментальные данные по соответствующим суткам
исследования усредняют по повторностям и рассчитанные проценты погибших
экземпляров тест-объекта вносят в таблицу 3.2.1, где представлены данные
по динамике гибели тест-организмов за 30 суток в растворе вещества с ЛК
50
за 24 ч, равной 10 мг/л.
Таблица 3.2.1
Гибель тест-организмов (%) при убывании исходной
концентрации вещества (ЛК50) по суткам экспозиции
(среднее 3-х повторностей)
┌───────────────┬─────────────────────────────────────────────────────────┐ │ Концентрация, │ Сутки исследований │ │ЛК за 24 часа├───────┬───────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┤ │ 50 │ 0 │ 3 │ 5 │ 7 │ 10 │ 15 │ 20 │ 30 │ │ 10 мг/л ├───────┴───────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┤ │ │ Гибель тест-объекта, % │ │ ├───────┬───────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┤ │ │ 50 │ 46,6 │ 40 │ 30 │ 16,6 │ 3,3 │ 0 │ 0 │ │ ├───────┴───────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┤ │ │Концентрация вещества в соответствии с ее убыванием по │ │ │ суткам, мг/л │ │ ├───────┬───────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┬──────┤ │ │ 10 │ 9,3 │ 8,0 │ 6,0 │ 3,3 │ 0,66 │ 0 │ 0 │ └───────────────┴───────┴───────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┴──────┘
3.2.6. На основании полученных данных по гибели тест-организмов в соответствующей емкости, методом пропорции определяется концентрация вещества для каждой величины процента погибших тест-объектов в эксперименте:
так, 50,0% погибших организмов соответствуют 10,0 мг/л;
46,6% - 9,3 мг/л;
40,0% - 8,0 мг/л;
30,0% - 6,0 мг/л;
16,6% - 3,3 мг/л;
3,3% - 0,66 мг/л.
Полученные значения убывающих концентраций вещества (мг/л) по суткам экспозиции также заносят в таблицу 3.2.1.
В случае распада вещества на 20 и на 30 сутки количество определений во времени (n) увеличивается с 6 до 7 - 8.
3.2.7. Далее расчет периода 95% распада вещества в воде определяют в соответствии с п. 3.1.2:
lgC = lgCo - t/тау, где
C - концентрация вещества в момент определения (мг/л);
Co - исходная концентрация (мг/л);
t - время (сутки);
тау - константа скорости убывания вещества в растворе (сут.).
Принимают lgC = y; lgCo = a; t = x; -1/тау = b, получают решаемое регрессионное уравнение: y = a + x · b.
Коэффициенты уравнения регрессии "a" и "b" вычисляют методом наименьших квадратов по уравнениям:
(SUMy - b · SUMx) n · SUMx · y - SUMx · SUMy
a = -------------------; b = -----------------------------, где
n 2 2
n · SUMx - (SUMx)
n - число определений во времени.
3.2.8. Соответствующие данные (расчетные концентрации вещества из таблицы 3.2.1) вносят в таблицу 3.2.2 и далее проводят преобразование экспериментальных результатов для дальнейшего расчета по формулам п. 3.2.7.
Таблица 3.2.2
Данные для расчета распада вещества на 95%
┌───────────┬────────────┬─────────────┬────────────┬──────────┬──────────┐ │ Число │ Сутки │Концентрация │ Логарифм │ x · lgC │ 2 │ │определений│исследований│ вещества │концентрации│ (x · y) │ X │ │во времени │ t = x │ C мг/л │ lgC = y │ │ │ │ N │ │ │ │ │ │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │1 │0 │10,0 │1,0000 │0 │0 │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │2 │3 │9,3 │0,9685 │2,9055 │9 │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │3 │5 │8,0 │0,9031 │4,5155 │25 │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │4 │7 │6,0 │0,7782 │5,4474 │49 │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │5 │10 │3,3 │0,5185 │5,180 │100 │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │6 │15 │0,66 │-0,1805 │-2,7075 │225 │ ├───────────┴────────────┴─────────────┴────────────┴──────────┴──────────┤ │ Значения сумм вышеуказанных показателей (SUM), вносимых в формулы │ │ расчета показателей a и b │ ├───────────┬────────────┬─────────────┬────────────┬──────────┬──────────┤ │ N │ SUMx │ │ SUMy │SUM(x · y)│ 2 │ │ │ │ │ │ │ SUMx │ ├───────────┼────────────┼─────────────┼────────────┼──────────┼──────────┤ │6 │40 │ │4,9878 │16,3459 │408 │ └───────────┴────────────┴─────────────┴────────────┴──────────┴──────────┘
3.2.9. Определяют 5% концентрацию вещества от исходной концентрации (10 мг/л) при его распаде на 95%.
В рассматриваемом примере концентрация вещества 0,5 мг/л является 5%-й концентрацией от исходной (10 мг/л) при распаде вещества на 95%.
Определяют lg0,5 = y (y = lgC = lg0,5 = -0,301).
3.2.10. Определяют по данным табл. 3.2.2 значения коэффициентов регрессии a и b (п. 3.2.7):
a = 1,6288; b = -0,1196.
Подставляют полученные значения в решаемое регрессионное уравнение (п. 3.2.7):
y = a + x · b, откуда следует: x = (y - a) / b, где x - время распада вещества на 95%;
x = (-0,301 - 1,6288) / -0,1196 = 16,1.
При округлении полученного значения x до целого числа записывают время распада вещества на 95% за 16 суток.
3.2.11. При наличии данных по химической стабильности вещества в растворе и данных по стабильности токсичности вещества может быть проведено сравнение полученных величин и сделан вывод о токсичности продуктов распада вещества.