4. Определение амилазной (диастазной) активности
Определение активности амилазы (диастазы) основано на способности этого фермента расщеплять крахмал, что определяют иодной реакцией. Данный показатель выражают амилазным (диастазным) числом (ед. Готе).
4.1. Аппаратура, материалы, реактивы.
Баня водяная с электрообогревом.
Весы лабораторные общего назначения 4 кл.
Пробирки стеклянные диаметром 20 мм и высотой 200 мм.
Стаканы химические вместимостью 50 и 100 см3.
Колбы мерные вместимостью 100, 200 см3.
Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 см3.
Крахмал растворимый, ч.
Натрий хлорид, ч.
Иод кристаллический, ч.
Калий иодид, ч.
Дистиллированная вода.
4.2. Подготовка к испытанию.
4.2.1. Приготовление раствора меда массовой концентрации 100 г/дм3 в пересчете на сухие вещества проводят по формулам 1 и 2
(1) X = (m * B) / C, где
X - количество раствора меда заданной концентрации в пересчете на сухие вещества, см3;
m - масса навески меда, г;
B - количество сухих веществ в меде, %;
C - заданная концентрация раствора меда, %.
(2) X1 = X - m, где
X1 - количество дистиллированной воды для приготовления меда массовой концентрации 100 г/дм3, см3;
X - количество раствора меда заданной концентрации в пересчете на сухие вещества, см3;
m - масса навески меда, г.
4.2.2. Приготовление раствора натрия хлорида массовой концентрации 5,8 г/дм3.
0,58 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют дистиллированной водой и доводят объем до метки.
4.2.3. Приготовление раствора иода.
1 г калия иодида помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 40 - 50 см3 дистиллированной воды, взбалтывают, затем вносят 0,5 г иода, растворяют и доводят дистиллированной водой объем до метки.
4.2.4. Приготовление раствора крахмала массовой концентрации 10 г/дм3.
1 г растворимого крахмала размешивают в стаканчике вместимостью 50 см3 с 20 см3 дистиллированной воды и количественно переносят в коническую колбу, где несильно кипит 80 см3 дистиллированной воды. Кипятят 2 - 3 мин., затем колбу охлаждают до 20 градусов C, содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки.
4.2.5. Проведение испытания.
В 10 пробирок разливают раствор меда и другие компоненты согласно табл. 3.
Приложение к пп. 4.2.5
Таблица 3
КОМПОНЕНТЫ РЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ
АМИЛАЗНОЙ (ДИАСТАЗНОЙ) АКТИВНОСТИ
┌──────────────┬─────────────────────────────────────────────────┐ │ │ Номер пробирки │ │ Компоненты ├────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┬────┤ │ │ 1 │ 2 │ 3 │ 4 │ 5 │ 6 │ 7 │ 8 │ 9 │ 10 │ ├──────────────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┤ │Раствор меда, │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │массовой кон- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │центрации │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │100 г/дм3, см3│1,0 │1,3 │1,7 │2,1 │2,8 │3,6 │5,0 │6,0 │7,1 │10 │ │Дистиллирован-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ная вода, см3 │9,0 │8,7 │8,3 │7,9 │7,2 │6,4 │5,0 │4,0 │2,9 │ - │ │Раствор натрия│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │хлорида массо-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │вой концентра-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ции │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │5,8 г/дм3, см3│0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │0,5 │ │Раствор крах- │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │мала массовой │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │концентрации │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │10 г/дм3, см3 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │5,0 │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ Водяная баня при температуре (40 + - 1) градусов C │ │ в течение 1 часа │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │Раствор иода │ по одной капле │ │Амилазное │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │(диастазное) │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │число, │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ед. Готе │50,0│38,0│29,4│23,8│17,9│13,9│10,0│8,0 │7,0 │5,0 │ └──────────────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┘
Пробирки закрывают пробками, тщательно перемешивают содержимое, помещают в водяную баню на 1 час при температуре (40 + - 1) градусов C. Вынимают из водяной бани, охлаждают под струей воды до комнатной температуры, после чего в каждую пробирку вносят по одной капле раствора иода.
4.2.6. Оценка результатов.
Первая пробирка слева, в которой образуется желтоватая окраска, соответствует амилазной (диастазной) активности в исследуемом меде.
4.3. Определение предельного амилазного (диастазного) числа.
Предельным амилазным (диастазным) числом называется минимальная амилазная (диастазная) активность, установленная настоящими Правилами.
При исследовании белоакациевого, липового, подсолнечникового, хлопчатникового медов определение ведут по пробирке N 10 табл. 3, остальных видов - по пробирке N 7.
4.4. Определение амилазного (диастазного) числа по пп. 4.2.5 можно ускорить за счет снижения концентрации раствора крахмала.
Использование раствора крахмала массовой концентрации 2,5 г/дм3 позволяет сократить продолжительность инкубирования в водяной бане до 10 мин.