Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
27 декабря 1999 года
Дата введения -
с момента утверждения
4. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ
ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.2.801-99
1. Разработаны: Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава России (Подунова Л.Г., Кривопалова Н.С., Стреляева Н.Е.), Научно-производственным центром "Гидробиос" Федерального управления медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве России (Герасимова Г.А., Синилов С.К., Бутова Л.Г., Критская И.В.), Научно-исследовательским институтом медицины труда РАМН (Просветова Н.К., Александрова Л.З., Иванова Л.А., Фролова Я.А.).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 27 декабря 1999 г.
3. Введены впервые.
1. Общие положения
1.1. Настоящие Методические указания предназначены для обеспечения контроля качества парфюмерно-косметических изделий по микробиологическим показателям, введенным СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции", и устанавливают методы лабораторных испытаний качества парфюмерно-косметической продукции по микробиологическим показателям безопасности для здоровья человека, проводимых в порядке производственного контроля, государственного санитарно-эпидемиологического надзора и при испытании указанной продукции в целях сертификации соответствия.
1.2. Методические указания предназначены для использования в аккредитованных бактериологических производственных, испытательных лабораториях и лабораториях организаций государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и позволяют проводить контроль на соответствие СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции".
1.3. Данный документ разработан в связи с необходимостью унификации и усовершенствования методов микробиологического анализа парфюмерно-косметической продукции.
Методы адаптированы к условиям работы лабораторий, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции.
1.4. Настоящие Методические указания должны учитываться при пересмотре действующей и разработке вновь создаваемой нормативной документации на парфюмерно-косметическую продукцию.
2. Нормативные ссылки
2.1. Закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" от 30.03.99 N 52-ФЗ.
2.2. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 15.06.94 N 625.
2.3. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе РФ, утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 30.06.98 N 680.
3. Методы отбора и подготовки проб
для микробиологического анализа
3.1. Отбор проб
3.1.1. При отборе проб следует руководствоваться требованиями ГОСТ 29188.0-91 "Парфюмерно-косметические изделия. Правила приемки, отбор проб, методы органолептических испытаний" и ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов".
3.1.2. Пробы парфюмерно-косметических изделий для микробиологического анализа отбирают до отбора проб для физико-химических, органолептических и других видов испытаний с соблюдением правил асептики, для того чтобы исключить вторичное микробное загрязнение продукта.
3.1.3. От каждой партии парфюмерно-косметических изделий, подлежащих контролю, следует брать не менее трех единиц изделий в потребительской таре (упаковке), которая не должна иметь следов повреждений.
3.1.4. При испытаниях на стерильность от каждой партии парфюмерно-косметических изделий, независимо от ее объема, отбирают 10 ампул или 10 других единиц упаковки.
3.1.5. Пробу, отобранную от отдельной единицы упаковки, называют разовой. Количество продукта в разовых пробах из каждой единичной упаковки должно быть одинаковым. Разовые пробы соединяют, перемешивают и составляют среднюю пробу.
3.2. Подготовка проб к анализу
3.2.1. Подготовка проб для определения
микробиологической чистоты
3.2.1.1. Перед вскрытием упаковки место соединения крышки с тарой обрабатывают 70%-ным раствором этилового спирта. Первую порцию в количестве примерно 10% содержимого упаковки отбрасывают, затем отбирают пробы и переносят в стерильную колбу или флакон вместимостью 100 - 200 куб. см.
3.2.1.2. Для испытания готовят среднюю пробу не менее 15 г (куб. см) из упаковок, отобранных по п. 3.1.3, и состоящую из равных разовых проб. Такое же количество упаковок используют и для повторных испытаний. В случае, если масса (объем) парфюмерно-косметического средства в единичной упаковке менее 5 г (куб. см), содержимое исследуют полностью или используют большее количество упаковок.
3.2.1.3. (5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб. см) средней пробы отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45 +/- 1) куб. см или (90 +/- 1) куб. см 1%-ного раствора твина-80 в физиологическом растворе (п. 6.4.2). Смесь тщательно перемешивают в течение 15 - 30 мин. до полной гомогенизации (либо помещают на аппарат для встряхивания). При необходимости пробы прогревают на водяной бане или в термостате до 40 - 45 °C, но не более 10 мин. Для гомогенизации продукции, плохо растворимой в воде, используют стеклянные бусы.
Эмульсии типа вода-масло подготавливают аналогичным способом, используя 4%-ный раствор твина-80 в физиологическом растворе (п. 6.4.2) и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до 40 - 45 °C в течение 20 мин.
Получают смесь, в 10 г (куб. см) которой содержится 1 г (куб. см) парфюмерно-косметического средства - первое разведение 1:10 -1 (10 ). При необходимости делают последующие десятикратные 1:100 -2 -3 (10 ) и 1:1000 (10 ) разведения.
3.2.1.4. Полученные разведения используют для посевов. Время с момента окончания подготовки пробы до начала высева не должно превышать 30 мин.
3.2.1.5. Определение собственной антимикробной активности парфюмерно-косметической продукции.
Метод основан на подавлении роста тест-штаммов микроорганизмов под действием испытуемого парфюмерно-косметического средства. В качестве тест-штаммов используют Bacillus subtilis АТСС 6633 (или Bacillus cereus АТСС 10702), Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 (или Pseudomonas aeruginosa ГИСК 453), Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р и культуру Candida albicans АТСС 885-653.
Определение собственной антимикробной активности проводится для парфюмерно-косметических средств, в состав которых входят консерванты и другие вещества, обладающие антимикробным действием.
Собственная антимикробная активность определяется однократно для каждой конкретной рецептуры парфюмерно-косметического средства.
Культуры Bacillus subtilis (Bacillus cereus), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus выращивают на одной из жидких сред по п. 6.4.11.1 или п. 6.4.11.2 при температуре (37 +/- 1) °C в течение (19 +/- 1) ч. Культуру Candida albicans выращивают на жидкой среде Сабуро по п. 6.4.8.1 при температуре (30 +/- 1) °C в течение (48 +/- 3) ч.
Из каждой выросшей культуры готовят взвесь микроорганизмов, добавляя физиологический раствор по п. 6.4.1 в соотношении 1:1000.
В пробирки вносят по 1 куб. см первого разведения испытуемой пробы парфюмерно-косметического средства по п. 3.2.1.3 и добавляют:
- в пробирку N 1 - 10 куб. см буферного раствора по п. 6.4.16 и 1 куб. см взвеси Bacillus subtilis (Bacillus cereus);
- в пробирку N 2 - 10 куб. см буферного раствора по п. 6.4.16 и 1 куб. см взвеси Candida albicans;
- в пробирку N 3 - 10 куб. см одной из питательных сред по п. 6.4.9 и 1 куб. см взвеси Escherichia coli;
- в пробирку N 4 - 10 куб. см одной из питательных сред по п. 6.4.11 и 1 куб. см взвеси Pseudomonas aeruginosa;
- в пробирку N 5 - 10 куб. см одной из питательных сред по п. 6.4.13 и 1 куб. см взвеси Staphylococcus aureus.
Контролем служат пробирки с питательными средами и соответствующими тест-штаммами, в которые вместо испытуемого парфюмерно-косметического средства вносят то же количество стерильной дистиллированной воды.
Посевы инкубируют при (30 +/- 1) °C в течение (48 +/- 3) ч.
В случае отсутствия роста тест-штаммов микроорганизмов на соответствующих питательных средах отмечают антимикробное действие испытуемого средства.
Для устранения антимикробного действия входящих в состав парфюмерно-косметических средств консервантов или веществ, обладающих антимикробным действием, среднюю пробу в количестве (5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб. см) отбирают стерильно и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45 +/- 1) куб. см или (90 +/- 1) куб. см 4%-ного раствора твина-80 в физиологическом растворе, или увеличивают разведение испытуемой пробы.
Дальнейшие испытания проводят в соответствии с п. 4.
3.2.2. Подготовка проб к анализу на стерильность
Испытание парфюмерно-косметических средств на стерильность проводят методом прямого посева или методом мембранных фильтров.
Метод мембранных фильтров не применим для суспензий или гомогенатов парфюмерно-косметических средств, загрязняющих при фильтрации поры фильтров.
3.2.2.1. Перед вскрытием ампулы с парфюмерно-косметической продукцией обрабатываются этиловым спиртом. Шейка ампулы осторожно прогревается в пламени горелки. На хорошо прогретую шейку ампулы капают 1 каплю стерильного физиологического раствора (п. 6.4.1). Ампулы осторожно вскрывают по месту образовавшейся в стекле трещины.
3.2.2.2. Содержимое 10 ампул или 10 других упаковок объединяют в единую пробу. Из объединенной пробы отбирают стерильно (5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб. см) парфюмерно-косметического средства.
При испытаниях методом прямого посева отобранные пробы непосредственно засевают в соответствующие питательные среды.
При испытаниях методом мембранных фильтров отобранные пробы помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие соответственно (45 +/- 1) куб. см или (90 +/- 1) куб. см стерильного 1%-ного раствора твина-80 в физиологическом растворе, предварительно пропущенного через мембранный фильтр с размером пор (0,45 +/- 0,02) мкм. Пробы тщательно перемешивают в течение 15 - 20 мин. до полной гомогенизации.
При испытании масляных растворов пробы подготавливают аналогичным способом, используя 4%-ный раствор твина-80 в физиологическом растворе и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до 40 - 45 °C в течение 20 мин.
4. Методы анализа
При микробиологическом контроле парфюмерно-косметической продукции используют стандартизованные методы микробиологического посева. Определяют следующие группы микроорганизмов: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы; дрожжи, дрожжеподобные и плесневые грибы; бактерии семейства Enterobacteriaceae; бактерии вида Staphylococcus aureus; бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.
В микробиологических лабораториях, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции, допускается применение импедансного метода в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием экспресс-анализатора "Бак Трак 4100", утвержденными 18.11.96 Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора. Использование прибора "Бак Трак 4100" позволяет сократить время испытаний и получить результат через 6 - 8 ч после начала исследований. Прибор аттестован и внесен в Государственный реестр (N 14313-94).
4.1. Определение общего количества мезофильных аэробных
и факультативно-анаэробных бактерий
4.1.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов при культивировании посевов в аэробных условиях при температуре (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) ч в пересчете их количества на 1 г (куб. см) исследуемого продукта.
4.1.2. Проведение анализа
Для определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 300 колоний.
Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.
4.1.2.1. Метод глубинного посева
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 мин. после внесения материала, его заливают 15 - 20 куб. см одной из сред по п. 6.4.7, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °C. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) ч.
4.1.2.2. Двухслойный агаровый метод
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, вносят в каждую из двух пробирок с 4 куб. см одной из сред по п. 6.4.7, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °C. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей средой, распределяя его равномерно по поверхности среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) ч.
4.1.2.3. Обработка результатов
Просмотр посевов осуществляется каждый день.
Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.
Подсчитывают количество колоний на тех чашках, где их выросло от 15 до 300, суммируют и находят среднее арифметическое из них.
Допускается учитывать колонии с помощью лупы с 5х увеличением.
Полученное среднее арифметическое число колоний округляют следующим образом:
- если число меньше 100 - его округляют до ближайшего числа, кратного 5;
- если число больше 100 и его последняя цифра 5 - его округляют до ближайшего числа, кратного 20;
- если число больше 100 и его последняя цифра не 5 - его округляют до ближайшего числа, кратного 10.
Количество микроорганизмов в 1 г продукта (X) вычисляют по формуле:
N
X = а x 10 / q,
где:
а - округленное среднее арифметическое число колоний;
q - объем посевного материала, внесенного в чашку, куб. см;
N - степень десятикратного разведения продукта.
Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным
N
на 10 , где N - соответствующая степень десятикратного разведения
продукта.
Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста
1
бактерий, то результат записывают так: менее 1,0 x 10 клеток на
1 г (куб. см).
Если на чашках выросло более 300 колоний, то посевы повторяют, используя более высокие разведения продукта.
4.2. Определение количества дрожжей, дрожжеподобных
и плесневых грибов
4.2.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов, типичных по макро- и (или) микроскопической морфологии, на селективной агаризованной питательной среде Сабуро, при культивировании посевов при температуре (30 +/- 1) °C в течение (120 +/- 3) ч.
4.2.2. Проведение анализа
Для определения количества дрожжей и плесневых грибов выбирают те разведения, при посеве которых на чашках вырастает не менее 15 и не более 150 колоний для дрожжей и не менее 5 и не более 50 - для плесеней.
Посев осуществляют глубинным или двухслойным агаровым методами.
4.2.2.1. Метод глубинного посева
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, высевают параллельно в две чашки Петри для каждого разведения. При посеве крышку чашки Петри слегка приоткрывают и посевной материал вносят на дно чашки. Не позже чем через 15 мин. после внесения материала его заливают 15 - 20 куб. см предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/ -1) °C агаризованной среды Сабуро по п. 6.4.8. Чашки с посевами, залитыми питательной средой, осторожно вращают, чтобы посевной материал равномерно распределился по всей питательной среде. Затем чашки с посевами оставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (120 +/- 3) ч.
4.2.2.2. Двухслойный агаровый метод
По 1 куб. см исследуемого материала из разведений, приготовленных по п. 3.2.1.3, вносят в каждую из двух пробирок с 4 куб. см предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °C агаризованной среды Сабуро. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в чашки Петри с застывшей агаризованной средой Сабуро, распределяя его равномерно по поверхности среды.
После застывания среды чашки помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (120 +/- 3) ч.
4.2.2.3. Обработка результатов
Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.
Просмотр посевов осуществляется каждый день, предварительный учет типичных колоний проводят через (72 +/- 3) ч термостатирования посевов, а окончательный - через (120 +/- 3) ч.
На поверхности плотной среды рост и развитие дрожжей и дрожжеподобных грибов характеризуется появлением плоских или выпуклых колоний белого или кремового, иногда серо-белого цвета. В глубине агара дрожжи образуют чечевицеобразные колонии.
Развитие плесневых грибов характеризуется появлением сметанообразных, слизистых колоний различной окраски с последующим опушением.
Подсчитывают все выросшие колонии, суммируют и находят среднее арифметическое из них.
Допускается учитывать колонии с помощью лупы с 5х увеличением.
Полученное среднее арифметическое число колоний, если необходимо, округляют как описано в п. 4.1.2.3.
Количество дрожжей и плесневых грибов в 1 г (куб. см) продукта (X) вычисляют по формуле:
N
X = а x 10 / q,
где:
а - округленное среднее арифметическое число колоний;
q - объем посевного материала, внесенного в чашку, куб. см;
N - степень десятикратного разведения продукта.
Результаты анализа выражаются числом от 1,0 до 9,9, умноженным
N
на 10 , где N - соответствующая степень десятикратного разведения
продукта.
Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста дрожжей и плесневых грибов, то результат записывают так: "не обнаружены".
Если на чашках выросло более 150 колоний, то посевы повторяют, используя более высокие разведения продукта.
4.3. Выявление и идентификация бактерий
сем. Enterobacteriaceae
К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты.
4.3.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.
4.3.2. Проведение испытания
-1
10 куб. см исследуемого материала из разведения 10 ,
приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон
вместимостью 200 куб. см, содержащий 100 куб. см одной из
питательных сред по п. 6.4.9. Смесь перемешивают и инкубируют при
температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии признаков роста на средах накопления (помутнение среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей на чашки Петри со средой Эндо (п. 6.4.10.1). Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют колонии круглые, малиновые с металлическим блеском или без него, розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 1 - 4 мм.
При окраске по Граму наблюдаются грамотрицательные неспорообразующие палочки.
При отсутствии роста на среде Эндо типичных для семейства Enterobacteriaceae колоний считают, что в образце нет представителей данного семейства.
Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч. Культуры проверяют на чистоту.
Чистые культуры исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы, для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы (п. 6.4.6) и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2 - 5 мин., свидетельствует о положительной оксидазной реакции.
При отрицательной оксидазной реакции культуры пересевают петлей на среду для определения ферментации глюкозы по п. 6.4.10.2 (допускается использование О/F-теста) и в среду для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты по п. 6.4.10.3.
В половину пробирок со средой для определения ферментации глюкозы вносят по 0,5 куб. см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч. При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.
При проведении О/F-теста посев производят уколом в два столбика со средой Хью-Лейфсена по п. 6.4.10.4, один из которых заливают 1 куб. см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч. При положительной реакции происходит изменение цвета среды при культивировании как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
О наличии нитритов в среде судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса (п. 6.4.5). Для чего к суточной исследуемой культуре на среде для определения наличия нитритов приливают 0,2 - 0,3 куб. см реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.
4.3.3. Обработка результатов
Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано бактериями сем. Enterobacteriaceae.
4.4. Выявление и идентификация Pseudomonas aeruginosa
Микроорганизмы вида Pseudomonas aeruginosa представляют собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию, образуют проникающий в субстрат пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного, и способны к росту при температуре (42 +/- 1) °C.
4.4.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении бактерий вида Pseudomonas aeruginosa с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.
4.4.2. Проведение испытаний
-1
10 куб. см исследуемого материала из разведения 10 ,
приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон
вместимостью 200 куб. см, содержащий 100 куб. см одной из
питательных сред по п. 6.4.11. Смесь перемешивают и инкубируют
при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии признаков роста в среде накопления делают пересев петлей на чашки с одной из питательных сред по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии роста зеленоватых, флюоресцирующих колоний, обладающих характерным запахом и окрашивающих среду, из них делают мазки и окрашивают по Граму.
Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч. Культуры проверяют на чистоту.
Чистые культуры колоний исследуют на наличие цитохромоксидазы. Для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы (п. 6.4.6) и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2 - 5 мин., свидетельствует о положительной оксидазной реакции.
Оксидазоположительные колонии пересевают петлей на среду Кинг-А (п. 6.4.12) и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
На среде Кинг-А культура Pseudomonas aeruginosa образует пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного и проникающий в субстрат.
Для дополнительного подтверждения принадлежности в виду Pseudomonas aeruginosa чашки со средой Кинг-А инкубируют при температуре (42 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.
Культура Pseudomonas aeruginosa растет в вышеуказанных условиях с образованием сине-зеленого пигмента.
4.4.3. Обработка результатов
Если в результате исследований обнаружены колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, дающих положительную оксидазную реакцию, образующие пигмент или без него и дающие рост при 42 °C, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa.
4.5. Выявление и идентификация Staphylococcus aureus
Микроорганизмы вида Staphylococcus aureus представляют собой грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью, сбраживающие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции.
4.5.1. Сущность метода
Метод основан на выявлении бактерий вида Staphylococcus aureus с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.
4.5.2. Проведение испытаний
-1
10 куб. см исследуемого материала из разведения 10 ,
приготовленного по п. 3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон
вместимостью 200 куб. см, содержащий 100 куб. см одной из
питательных сред по п. 6.4.13. Смесь перемешивают и инкубируют
при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При наличии признаков роста делают пересев петлей на чашки с одной из сред: п. 6.4.14.1 - желточно-солевой агар или п. 6.4.14.2 - Байрд-Паркер агар, или п. 6.4.14.3 - маннитно-солевой агар. Посевы на желточно-солевой и Байрд-Паркер агар инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (48 +/- 3) ч, а посевы на маннитно-солевой агар - в течение (24 - 48 +/- 3) ч.
При росте на желточно-солевом агаре Staphylococcus aureus образует круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара колонии с ровными краями диаметром 2 - 2,5 мм, окрашенные в желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет, окруженные зоной лецитиназной активности.
На среде Байрд-Паркер Staphylococcus aureus растет в виде черных блестящих колоний диаметром 1 - 1,5 мм, окруженных зоной лецитиназной активности.
Наличие на маннитно-солевом агаре колоний, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о способности этих микроорганизмов ферментировать маннит.
Из подозрительных по морфологии колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную или близкую к ней форму с диаметром 0,6 - 1,0 мкм и располагаются обычно в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
При обнаружении грамположительных кокков делают пересев на одну из скошенных сред, приготовленных по п. 6.4.7. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.
Выделенную чистую культуру пересевают в среду Гисса с маннитом или мальтозой по п. 6.4.14.4, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом). Инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.
В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдается ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.
Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.
Для проведения реакции в стерильную пробирку с 0,5 - 1,0 куб. см плазмы крови кролика, разведенной в 3 - 4 раза или приготовленной из сухого препарата промышленного производства, вносят одну петлю суточной агаровой культуры. Одну пробирку с плазмой крови оставляют незасеянной для контроля. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч. Результат учитывают через 2, 4, 6 и 24 ч.
При отсутствии свертывания плазмы через 24 ч исследуемую культуру относят к коагулазоотрицательной.
Реакцию считают положительной при образовании даже небольшого сгустка.
4.5.3. Обработка результатов
Если в результате исследований обнаружены колонии грамположительных кокков, ферментирующие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Staphylococcus aureus.
4.6. Испытание на стерильность
4.6.1. Метод прямого посева
4.6.1.1. Сущность метода
Метод основан на способности основного большинства как аэробных, так и анаэробных бактерий давать видимый рост на тиогликолевой среде, а дрожжей, дрожжеподобных и плесневых грибов на среде Сабуро.
4.6.1.2. Проведение испытания
Из объединенной пробы, приготовленной по п. 3.2.2.2, отбирают стерильно по (5,0 +/- 0,1) г (куб. см) или (10,0 +/- 0,1) г (куб. см) испытуемого средства и высевают в два стеклянных флакона (параллельные определения) вместимостью 100 или 200 куб. см, содержащие 50 или 100 куб. см жидкой среды Сабуро по п. 6.4.8.1 и 50 или 100 куб. см тиогликолевой среды по п. 6.4.15 соответственно.
Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C, а посевы в тиогликолевой среде при температуре (30 - 35) °C в течение 14 сут. Посевы просматривают ежедневно.
4.6.3. Метод мембранных фильтров
4.6.3.1. Сущность метода
Метод мембранных фильтров основан на фильтрации растворов через мембранные фильтры с размером пор не более (0,45 +/- 0,02) мкм, на которых улавливается основное количество микроорганизмов, с последующим культивированием их в тиогликолевой среде и в жидкой среде Сабуро.
4.6.3.2. Проведение испытания
Фильтрование проводят в стерильных условиях с использованием фильтрационной установки, включающей фильтродержатель, соединенный с колбой приемником. Фильтродержатель состоит из воронки с крышкой и основания из пористой пластины, на которую помещается мембранный фильтр.
Фильтрационную установку стерилизуют любым способом, обеспечивающим сохранность рабочих характеристик мембран, а также стерильность мембран и всей установки.
Для фильтрации используют нитратцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор (0,45 +/- 0,02) мкм, диаметром около 47 мм (мембрана "Владипор" типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5 или другие, удовлетворяющие требованиям).
Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт. ст.).
Для фильтрования продуктов, содержащих небольшое количество взвешенных частиц, используют предварительную фильтрацию через префильтр. В качестве префильтров можно использовать фильтры типа АР 15 (Millipore), картон для предварительной фильтрации марки КФБЖ, картон для предварительной фильтрации марки КФМП и другие материалы, способные эффективно задерживать твердые частицы.
Пробу, подготовленную по п. 3.2.2.2, немедленно фильтруют. Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. После окончания фильтрации мембрану отмывают 3 - 5 порциями по 100 куб. см стерильного физиологического раствора для полного удаления с поверхности фильтра веществ, препятствующих росту микроорганизмов.
После отмывания мембрану немедленно извлекают из фильтродержателя, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в стеклянный флакон вместимостью 100 или 200 куб. см, содержащий 50 или 100 куб. см жидкой среды Сабуро по п. 6.1.9.1, а вторую половину - в стеклянный флакон, содержащий 50 или 100 куб. см тиогликолевой среды по п. 6.1.16 соответственно.
Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C, а посевы в тиогликолевой среде - при температуре 30 - 35 °C в течение 7 сут. Посевы просматривают ежедневно.
4.6.4. Обработка результатов
Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленные рост микроорганизмов подтверждают микроскопированием.
Испытуемая продукция считается стерильной при отсутствии роста микроорганизмов.
При обнаружении роста хотя бы в одном флаконе его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. В случае роста при повторном испытании микроорганизмов, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными при первичном посеве, испытуемую продукцию считают нестерильной. Если при повторном посеве наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально выделенных, испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При наличии роста хотя бы в одном флаконе при третьем испытании косметическую продукцию считают нестерильной.
5. Микробиологические нормативы
для парфюмерно-косметической продукции
Микробиологическому контролю подлежат средства для ухода за кожей лица и тела (косметические кремы, кремообразные маски, косметическое молочко, косметические эмульсии, шампуни, жидкие мыла, гели для душа и ванн, пены для ванн, бальзамы, дезодоранты, депилятории, средства для и после бритья, лосьоны-тоники, лосьоны, тоники), средства декоративной косметики (в т.ч. средства для глаз: жидкая тушь, средства для подведения линии глаз, компактные сухие и жидкие тени для век, губная помада, пудра, румяна компактные и кремообразные), детская косметика и парфюмерия, средства для ухода за волосами (шампуни, ополаскиватели, бальзамы, маски, средства для укладки волос и др.), средства интимной гигиены, специальная косметическая продукция (средства для загара, фотозащитные средства и др.), косметические средства разового использования (в ампулах, капсулах и др.), душистые воды.
Обязательному микробиологическому контролю также подлежит сырье природного и синтетического происхождения и другие компоненты, входящие в состав косметических средств (биологически активные вещества - действующее начало, ингредиенты основы - структурообразующие эмульгаторы, поверхностно-активные компоненты, солюбилизаторы, консерванты и др.).
Не подлежат обязательному микробиологическому контролю готовые средства, содержащие более 25% этилового спирта, окислительные краски для волос и ногтей.
Микробиологические показатели безопасности парфюмерно-косметической продукции в соответствии с требованиями СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции" (прилож. 2), приведены в табл. 1.
Таблица 1
┌─────┬──────────┬───────────┬────────┬──────────┬───────┬───────┐ │Груп-│Вид косме-│Общее коли-│Дрожжи, │Бактерии │Staphy-│Pseudo-│ │пы │тической │чество ме- │дрожже- │семейства │lococ- │monas │ │ │продукции │зофильных │подобные│Enterobac-│cus │aerugi-│ │ │ │аэробных и │и плес- │teriaceae │aureus │nosa │ │ │ │факульта- │невые │ │ │ │ │ │ │тивно-анаэ-│грибы │ │ │ │ │ │ │робных бак-│ │ │ │ │ │ │ │терий │ │ │ │ │ │ │ │МАФАнМ │ │ │ │ │ │ │ ├───────────┴────────┴──────────┴───────┤ │ │ │ │ КОЕ в 1 г (куб. см) продукции │ │ ├─────┼──────────┼───────────────────────────────────────┴───────┤ │I │Ампульная │ Стерильная продукция │ │груп-│косметика,│ │ │па │используе-│ │ │ │мая для │ │ │ │введения │ │ │ │методом │ │ │ │электро- │ │ │ │фореза │ │ ├─────┼──────────┼───────────┬────────┬──────────┬───────┬───────┤ │II │Детская │Не более │Отсут- │Отсутствие│Отсут- │Отсут- │ │груп-│косметика.│ 2 │ствие │ │ствие │ствие │ │па │Косметика │1 x 10 │ │ │ │ │ │ │для глаз │ │ │ │ │ │ ├─────┼──────────┼───────────┼────────┼──────────┼───────┼───────┤ │III │Остальная │Не более │Не более│Отсутствие│Отсут- │Отсут- │ │груп-│косметика │ 3 │ 2 │ │ствие │ствие │ │па │ │1 x 10 │1 x 10 │ │ │ │ └─────┴──────────┴───────────┴────────┴──────────┴───────┴───────┘
6. Аппаратура, растворы реактивов, питательные среды
6.1. Аппаратура
Весы лабораторные квадрантные ГОСТ 24104-88Е 4-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г Весы лабораторные 2-го класса точности ГОСТ 24104-88Е с наибольшим пределом взвешивания 200 г рН-метр любой марки с набором электродов с погрешностью измерений +/- 0,1 рН Термометр 0 - 100 °C, цена деления 1 °C ГОСТ 28498-90 Автоклав (паровой стерилизатор) ГОСТ 19569-89Е Аппарат для встряхивания Баня водяная с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру 40 - 45 °C Дистиллятор электрический ДЭ-4 Лупа с пятикратным увеличением ГОСТ 25706-83 Прибор для счета колоний бактерий Прибор вакуумного фильтрования ПВФ-47 Спиртовка ГОСТ 25336-82Е Термостаты электрические суховоздушные с автоматическим терморегулятором до 50 °C, позволяющие поддерживать заданную температуру с погрешностью +/- 1 °C
6.2. Питательные среды и реактивы
Агар микробиологический ГОСТ 17206-96
Агар сухой питательный ФС 42-188ВС-90
для культивирования микроорганизмов
Агар Эндо ФС 42-186ВС-88
Бромкрезоловый пурпурный (индикатор) ГФ XI изд.
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Вода мясная ГОСТ 10444.1-84
Глюкоза ГОСТ 6038-79
Гидролизат казеина панкреатический
Глицерин ГОСТ 6824-96
Желчь сухая медицинская ОСТ 49278-75
Калий азотнокислый ГОСТ 4217-77
Калий сернокислый ГОСТ 4145-74
Калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75
Калий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 2493-75
Калия теллурит, раствор массовой
концентрацией 2%
Кислота соляная, раствор массовой ГОСТ 3118-77
концентрацией (HCl) = 0,1 моль/куб. дм
Кислота сульфаниловая ГОСТ 5821-78
Кислота тиогликолевая
Кислота уксусная ледяная ГОСТ 61-75
Литий хлористый, 6-водный ГОСТ 4328-77
Магний хлористый ГОСТ 4209-77
Малахитовый зеленый, индикатор ГФ XI изд.
Маннит ГОСТ 8321-74
Мальтоза
Масло вазелиновое ГОСТ 3164-78
Масло иммерсионное ГОСТ 13739-78
Метиленовый синий
Натрия гидроокись, раствор массовой ГОСТ 4328-77
концентрацией (NaOH) = 0,1 моль/куб. дм
Натрия резазурин, раствор массовой
концентрацией 1,0 г/куб. дм
Натрий сернистокислый, раствор массовой ТУ 6-09-5313-86
концентрацией (Na SO ) = 0,1 г/куб. дм
2 3
Натрия тиогликолят
Натрий хлористый ГОСТ 4233-77
Натрий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 245-76
Натрий фосфорнокислый двузамещенный ГОСТ 4172-76
N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорид,
раствор массовой концентрацией 1%
1-Нафтиламин ГОСТ 8827-79
1-Нафтол, спиртовый раствор ГОСТ 5838-79
массовой концентрацией 1%
Основа бактериологических питательных сред ФС 42-3407-97
сухая (Бактофок-МК)
Пептон сухой ферментативный ГОСТ 13805-76
для бактериологических целей
Питательная среда N 1 (для культивирования ВФС 42-1801-88
аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов), сухая
Питательная среда N 2 (для выращивания ВФС 42-1802-88
плесневых грибов), сухая
Питательная среда N 3 (обогащения для бак- ВФС 42-1803-88
терий семейства Enterobacteriaceae), сухая
Питательная среда N 6 (для определения ВФС 42-2038-91
ферментации глюкозы)
Питательная среда N 7 (для определения ВФС 42-2020-90
реакции нитратов в нитриты), сухая
Питательная среда N 8 (для выращивания ФС 42-3181-95
P. aeruginosa и S. aureus), сухая
Питательная среда N 9 (для выявления ВФС 42-1908-89
пигмента пиоцианина P. aeruginosa), сухая
Питательная среда N 10 (для идентификации ВФС 42-1909-89
S. aureus), сухая
Питательная среда для контроля стерильности, ФС 42-3390-97
сухая
Плазма кролика, сухая, цитратная
для реакции плазмокоагуляции
Цистин (цистеин)
Растворы и реактивы для окраски мазков ГОСТ 10444.1-84
по Граму
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 5962-67
Спирт этиловый ректификованный ГОСТ 18300-87
технический
Феноловый красный, индикатор ГФ XI изд.
Экстракт дрожжевой
6.3. Материалы
Бумага индикаторная универсальная Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81 Марля медицинская ОСТ 9412-93 Колбы плоскодонные конические или круглые ОСТ 25336-82 разной вместимости Картон для предварительной фильтрации ТУ 13-7308000691-84 марки КФБЖ Картон для предварительной фильтрации ТУ 13-7308001-673-84 марки КФМП Пипетки разной вместимости 2 класса точности ГОСТ 20292-74 Пробирки типов П1 и П2 ГОСТ 25336-82 Штативы для пробирок Шпатели Чашки Петри диаметром 90 - 100 мм ГОСТ 25336-82 Цилиндры на 100 - 250 куб. см ГОСТ 1770-74 Флаконы стеклянные градуированные вместимостью 100, 200, 500 мл ГОСТ 10782-85 Фильтры мембранные типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5 диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм ТУ 6-05-1903-81 Фильтры мембранные типа HAWG (Millipore) диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм Фильтры мембранные типа АР 15 (Millipore) диаметр 47 мм
Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов, материалов и питательных сред по качеству не ниже указанных.
6.4. Приготовление растворов реактивов и питательных сред
Для приготовления растворов реактивов и питательных сред используют дистиллированную воду, если нет специальных указаний, и реактивы квалификации "х.ч." или "ч.д.а."
Необходимое значение рН растворов и питательных сред устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия, раствор концентрации (NaOH) = 0,1 моль/куб. дм или раствора соляной кислоты, раствор концентрации (HCl) = 0,1 моль/куб. дм.
Значение рН растворов определяют потенциометрически при температуре (20 +/- 2) °C.
Ориентировочное определение рН растворов и питательных сред допускается проводить с помощью индикаторной бумаги.
6.4.1. Изотонический 0,85%-ный раствор хлористого натрия
(физиологический раствор)
0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.
6.4.2. Раствор твина-80
1,0 г или 4,0 г твина-80 растворяют соответственно в 99 куб. см или в 96 куб. см физиологического раствора, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.
6.4.3. Раствор фенолового красного массовой
концентрацией 1%
1,0 г фенолового красного растирают в ступке, добавляя небольшими порциями 28,2 куб. см раствора натрия гидроокиси массовой концентрацией 0,01 моль/куб. дм. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят водой до метки.
Хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4 - 10 °C.
6.4.4. Раствор малахитового зеленого массовой
концентрацией 0,5%
0,5 г малахитового зеленого помещают в стерильный флакон, заливают 100 куб. см горячей дистиллированной воды и помещают на сутки в термостат с температурой (37 +/- 1) °C, периодически перемешивая.
Хранят во флаконе из темного стекла при температуре 4 - 10 °C.
6.4.5. Реактив Грисса
Раствор N 1. 0,5 г кислоты сульфаниловой растворяют в 30 куб. см кислоты уксусной ледяной, прибавляют 100 куб. см воды, фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор годен в течение месяца.
Раствор N 2. 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 куб. см кипящей воды, охлаждают, прибавляют 30 куб. см кислоты уксусной ледяной, фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор годен в течение 7 сут.
Перед употреблением смешивают равные объемы растворов N 1 и N 2.
6.4.6. Реактив для определения наличия
фермента цитохромоксидазы
Раствор N 1. 1,0 г 1-нафтола растворяют в 100 куб. см спирта этилового.
Раствор N 2. 1,0 г N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорида растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды.
Перед употреблением смешивают растворы N 1 и N 2 в соотношении 2:3.
Хранят во флаконах нейтрального светозащитного стекла при температуре 4 - 10 °C в течение 14 сут.
6.4.7. Среды для культивирования аэробных
и факультативно-анаэробных бактерий
6.4.7.1. Мясо-пептонный агар с глюкозой
Пептон 10,0 г Мясная вода 1000 куб. см Натрия хлорид 5,0 г Глюкоза 1,0 г Агар микробиологический 13,0 г
Все ингредиенты растворяют в мясной воде, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C.
6.4.7.2. Питательный агар "МК" с глюкозой
Бактофок-МК 20,0 г Натрия хлорид 5,0 г Глюкоза 1,0 г Агар микробиологический 13,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C.
Допускается использовать агар сухой питательный для культивирования микроорганизмов или питательную среду N 1 сухую.
6.4.8. Среда для выращивания грибов (среда Сабуро)
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г Глюкоза или мальтоза 40,0 г Агар микробиологический 13,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 5,8 +/- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C.
Допускается использовать питательную среду N 2 сухую.
6.4.8.1. Среда Сабуро жидкая
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г Глюкоза или мальтоза 40,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 5,8 +/- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
6.4.9. Среды обогащения для бактерий сем. Enterobacteriaceae
6.4.9.1. Среда для выращивания бактерий
сем. Enterobacteriaceae
Пептон или Бактофок-МК 20,0 г Глюкоза 10,0 г Натрия фосфат двузамещенный 7,5 г Калия фосфат однозамещенный 2,5 г Феноловый красный 0,08 г Малахитовый зеленый 0,015 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Питательную основу и соли растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 куб. см 1%-ного раствора фенолового красного и 3 куб. см 0,5%-ного малахитового зеленого, устанавливают рН = 7,5 +/- 0,1, нагревают до полного растворения компонентов, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
6.4.9.2. Среда Мак-Конки
Пептон или Бактофок-МК 20,0 г Лактоза 10,0 г Желчь сухая 5,0 г Бромкрезоловый пурпурный 0,01 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения компонентов, устанавливают рН = 7,5 +/- 0,1, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 3 сухую.
6.4.10. Питательные среды для идентификации бактерий
сем. Enterobacteriaceae
6.4.10.1. Агар Эндо
Среду готовят, как указано на этикетке или по следующей прописи.
К 100 куб. см питательного агара, приготовленного по п. 6.4.8, соблюдая правила асептики, добавляют вместо глюкозы 1 г лактозы, растворенной в 5 куб. см стерильной воды, и подогревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин.
В отдельную пробирку наливают 1,0 куб. см насыщенного спиртового раствора фуксина основного, к которому добавляют свежеприготовленный водный раствор натрия сернистокислого массовой концентрацией 10% до обесцвечивания фуксина (бледно-розовый цвет). Полученную смесь добавляют в расплавленный лактозный агар, перемешивают, избегая вспенивания, и разливают в чашки Петри.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 5 сут.
6.4.10.2. Среда для определения ферментации глюкозы
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г Глюкоза 40,0 г Натрия хлорид 5,0 г Феноловый красный 0,08 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, прибавляют 8 куб. см 1%-ного раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,4 +/- 0,2, кипятят 1 мин., фильтруют и разливают в пробирки с поплавками по 4 - 5 куб. см. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. Затем как можно быстрее охлаждают среду.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
Допускается использовать среду N 6 сухую.
6.4.10.3. Среда для определения восстановления нитратов
в нитриты
Пептон или Бактофок-МК 5,0 г Натрия хлорид 5,0 г Калия нитрат 1,5 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде при нагревании, устанавливают рН = 7,4 +/- 0,2, кипятят 1 мин., фильтруют через бумажный фильтр и разливают в пробирки по 4 - 5 куб. см. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 7 сухую.
6.4.10.4. Среда Хью-Лейфсена
Пептон или Бактофок-МК 2,0 г Глюкоза 10,0 г Натрия хлорид 5,0 г Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,3 г Бромтимоловый синий 0,03 г Агар микробиологический 3,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Ингредиенты растворяют воде, добавляют заранее замоченный агар, нагревают до полного растворения всех компонентов, кипятят 2 - 3 мин., устанавливают рН = 7,4 +/- 0,1, добавляют 3 куб. см 1%-ного водного раствора бромтимолового синего. Среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 10 - 15 мл и стерилизуют при температуре (112 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Цвет среды до автоклавирования - синий, после - травянисто-зеленый.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
6.4.11. Среды для выращивания Pseudomonas aeruginosa
6.4.11.1. Мясо-пептонный бульон с глюкозой
Пептон 10,0 г Мясная вода 1000 куб. см Натрия хлорид 5,0 г Глюкоза 1,0 г
Все ингредиенты растворяют в мясной воде, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C.
6.4.11.2. Питательный бульон "МК" с глюкозой
Бактофок-МК 10,0 г Натрия хлорид 5,0 г Глюкоза 1,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения компонентов, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре 121 °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C.
6.4.11.3. Среда для выращивания P. aeruginosa
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г Глюкоза 2,5 г Натрия хлорид 5,0 г Калий фосфорнокислый двузамещенный 2,5 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Питательную основу и натрия хлорид растворяют в дистиллированной воде при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают рН = 7,3 +/- 0,2, кипятят 1 мин., фильтруют через бумажный фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
6.4.12. Среда для выявления пигмента пиоцианина
(Среда Кинг-А)
Пептон или Бактофок-МК 20,0 г Магния хлорид безводный 5,0 г Калия сульфат безводный 1,0 г Глицерин 10,0 куб. см Агар микробиологический 13,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты, кроме глицерина, растворяют в воде и оставляют на 15 мин. Затем вносят глицерин, тщательно перемешивают, растворяют при нагревании, устанавливают рН = 7,4 +/- 0,2, кипятят 1 мин., прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 9 сухую.
6.4.13. Среды для выращивания Staphylococcus aureus
6.4.13.1. Солевой бульон
В 1000 куб. см мясо-пептонного бульона или питательного бульона "МК" вносят 65,0 г натрия хлористого, перемешивают до полного растворения соли, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
6.4.13.2. Среда по п. 6.4.11.3.
6.4.14. Среды для идентификации Staphylococcus aureus
6.4.14.1. Желточно-солевой агар
Эмульсия яично-желточная: куриное яйцо протирают ватой, смоченной этиловым спиртом, помещают в стерильную чашку Петри, стерильным инструментом пробивают с противоположных сторон яйца два отверстия. Через одно отверстие полностью удаляют белок, затем, увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу с 50 куб. см физиологического раствора, содержимое встряхивают до получения однородной массы.
Хранят при температуре 4 - 10 °C.
В 100 куб. см одной из питательных сред, приготовленных по п. 6.1.8, расплавленной до 45 - 50 °C, вносят 9,5 г натрия хлористого и 10 куб. см яично-желточной эмульсии. Смесь перемешивают до полной гомогенизации компонентов и разливают в чашки Петри.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 5 сут.
6.4.14.2. Агар Байрд-Паркер
Основа среды. В 1000 куб. см одной из питательных сред, приготовленных по п. п. 6.4.11.1 или 6.4.11.2, вносят 17,9 г лития хлористого, 15 г агара микробиологического, 5,0 г экстракта дрожжевого, перемешивают и нагревают до полного растворения компонентов. Охлаждают до 50 - 60 °C, устанавливают рН = 6,9 +/- 0,1, разливают во флаконы по 100 куб. см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
Перед употреблением к 100 куб. см расплавленной и охлажденной до 45 - 50 °C основы среды прибавляют 0,5 куб. см 2%-ного раствора калия теллурита и 5 куб. см яично-желточной эмульсии, приготовленной как указано выше. Среду перемешивают до полной гомогенизации компонентов и разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки подсушивают в термостате.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 48 ч.
6.4.14.3. Маннитно-солевой агар
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г Натрия хлорид 75,0 г Маннит 10,0 г Феноловый красный 0,025 г Агар микробиологический 13,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все компоненты растворяют в воде, вносят 2,5 куб. см 1%-ного раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,6 +/- 0,2, кипятят 1 мин., прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют под давлением при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
Допускается использовать питательную среду N 10 сухую.
6.4.14.4. Среда Гисса с маннитом или мальтозой
Пептон или Бактофок-МК 10,0 г Натрия хлорид 5,0 г Маннит или мальтоза 10,0 г Феноловый красный 0,025 г Агар микробиологический 13,0 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все компоненты растворяют в воде, вносят 2,5 куб. см 1%-ного раствора фенолового красного, устанавливают рН = 7,6 +/- 0,2, кипятят 1 мин., прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют под давлением при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 4 - 10 °C не более 14 сут.
6.4.15. Среда для контроля стерильности
(тиогликолевая среда)
Среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке или по следующей прописи:
Панкреатический гидролизат казеина 15,0 г Дрожжевой экстракт 5,0 г Натрия хлорид 2,5 г Глюкоза 5,0 г Цистин (цистеин) 0,75 г Тиогликолевая кислота или 0,5 г тиогликолят натрия Раствор резазурина натрия (1:1000) 1,0 куб. см Агар микробиологический 0,75 г Вода дистиллированная 1000 куб. см
Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный заранее агар, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН = 7,2 +/- 0,2, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.
Хранят при температуре 10 - 25 °C в защищенном от света месте в течение 14 сут.
6.4.16. Буферный раствор
1,0 г пептона ферментативного (или Бактофок-МК), 4,3 г хлористого натрия, 7,23 г фосфорнокислого двузамещенного натрия и 3,56 г фосфорнокислого однозамещенного калия растворяют при нагревании в 1000 куб. см дистиллированной воды, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН = 7,0 и разливают в стеклянные флаконы по 400 куб. см, стерилизуют 15 мин. при температуре (121 +/- 1) °C.
Хранят при температуре 4 - 6 °C не более 14 сут.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".
2. СанПиН 1.2.631-97 "Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции".
3. ГОСТ 26670-91 "Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов".
4. ГОСТ 10444.15-94 "Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов".
5. ГОСТ 10444.2-94 "Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества Staphylococcus aureus".
6. ГОСТ 26668-85 "Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических анализов".
7. ГОСТ 26972-86 "Зерно, крупа, мука, толокно для продуктов детского питания. Методы микробиологического анализа".
8. ГОСТ 10444.1-84 "Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе".
9. "Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями", МЗ СССР N 04-723/3 от 17.12.84.
10. Методические указания МУК 4.2.590-96 "Бактериологические исследования с использованием экспресс-анализатора "Бак Трак 4100". Утв. 18.11.96 Государственным комитетом санитарно-эпидемиологического надзора.
11. Государственная Фармакопея XI изд.
12. Определитель бактерий Берджи /Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стенли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997.